这篇文档报道了一项原创性研究。以下是针对该研究的学术报告：
关于汉滩病毒（Hantaan Virus）抑制I型干扰素应答机制的研究报告
本研究由赵英华（东北林业大学野生动物与自然保护地学院、吉林大学第一医院传染病与病原生物学中心）、车力赫（吉林大学第一医院传染病与病原生物学中心）、潘明明（东北林业大学野生动物与自然保护地学院）、黄媛（东北林业大学野生动物与自然保护地学院）、方舒（东北林业大学野生动物与自然保护地学院）、王蒙蒙（东北林业大学野生动物与自然保护地学院）、隋丽岩（吉林大学第一医院传染病与病原生物学中心）、王泽东（吉林大学第一医院传染病与病原生物学中心）、杜芳（空军军医大学西京医院神经内科）、侯志军（东北林业大学野生动物与自然保护地学院，通讯作者）和刘泉（东北林业大学野生动物与自然保护地学院、吉林大学第一医院传染病与病原生物学中心、佛山大学生命科学与工程学院，通讯作者）合作完成。研究成果于2023年11月在线发表于学术期刊 Virology 的第589卷（2024年），文章编号为109942。
本研究属于病毒学与宿主免疫学交叉领域，聚焦于汉坦病毒科（Hantaviridae）的正汉坦病毒属（*Orthohantavirus*）成员——汉滩病毒（Hantaan virus, HTNV）的免疫逃逸机制。汉滩病毒是引起东亚地区（尤其是中国）肾综合征出血热（Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome, HFRS）的主要病原体，其临床特征包括发热、出血和肾损伤，死亡率可达5%至15%。目前，针对HTNV尚无有效的疫苗或抗病毒药物，因此深入理解其致病机制对于开发新型疗法至关重要。已知汉坦病毒能够抑制宿主的先天免疫反应，特别是I型干扰素（Type I Interferon, IFN-I）反应，以利于自身复制。然而，关于HTNV抑制IFN-I反应的具体分子机制，尤其是其囊膜糖蛋白Gc（glycoprotein C）的作用，仍未完全阐明。本研究旨在系统探究HTNV的核衣壳蛋白（Nucleocapsid Protein, NP）和Gc蛋白如何调控宿主免疫反应，特别是它们对RLR（RIG-I-like receptor, RIG-I样受体）信号通路的影响，并揭示其作用靶点，以期更全面地理解HTNV的致病机理。
本研究的工作流程严谨且层层递进，主要包含以下几个部分的研究过程：
首先，研究团队构建了带有GFP和Flag标签的HTNV NP和Gc蛋白表达质粒，并将其转染至人胚胎肾HEK293T细胞中，以GFP空载体作为对照。转染24小时后，通过流式细胞分选术（FACS）分选出GFP阳性细胞进行RNA测序（RNA-seq）分析（每组n=3）。这是研究的起点，旨在从全转录组水平上发现NP和Gc蛋白调控的宿主因子。通过主成分分析（PCA）、差异表达基因（Differential Expression Genes, DEGs）筛选（标准为|log2 (Fold Change)| > 1且p值 < 0.05），以及基于Reactome、GO（基因本体论）和KEGG（京都基因与基因组百科全书）数据库的功能富集分析，他们发现NP和Gc蛋白均显著下调了与干扰素信号通路相关的基因。蛋白质相互作用网络（Protein-Protein Interaction, PPI）分析进一步显示，这些下调的干扰素相关基因（如DDX58（即RIG-I）、OASL、IFIT1/2/3、STAT1）构成了一个核心调控子网络。这初步表明，HTNV的NP和Gc蛋白可能共同参与抑制宿主的IFN-I反应。
在获得转录组学线索后，研究进入功能验证阶段。研究人员在HEK293T细胞中分别转染NP、Gc或对照质粒，并用合成的双链RNA类似物聚肌胞苷酸（poly(I:C)）模拟病毒感染以激活IFN-I通路。通过定量实时聚合酶链反应（qPCR）检测，他们证实NP和Gc蛋白能显著降低poly(I:C)诱导的IFNB1、IFIT1等干扰素刺激基因（ISGs）的mRNA表达水平。接着，通过蛋白质印迹（Western blot）实验，他们发现NP和Gc蛋白能够抑制poly(I:C)诱导的TBK1和IRF3（干扰素调节因子3）的磷酸化，且Gc蛋白的抑制作用强于NP。此外，免疫荧光实验直观地显示，NP和Gc蛋白能够抑制poly(I:C)诱导的IRF3核转位。这些结果共同证实，HTNV的NP和Gc蛋白确实能够抑制由模式识别受体激活的I型干扰素抗病毒反应。
为了阐明NP和Gc蛋白作用于IFN-I通路的哪个具体环节，研究团队将目光聚焦于RLR信号通路。他们发现，在转录组数据中，NP和Gc均下调了DDX58（RIG-I）和IFIH1（MDA-5）这两个关键RLR受体及其下游基因的表达。因此，他们假设NP和Gc可能通过靶向RLR通路来抑制IFN-I。为了验证这一假设，他们在HEK293T细胞中进行了双荧光素酶报告基因实验。他们共转染了IFN-β启动子或干扰素刺激反应元件（ISRE）报告质粒、NP/Gc表达质粒，以及能够组成性激活RLR通路的RIG-IN（RIG-I的N端活性结构域）或MDA-5表达质粒。结果显示，NP和Gc能显著抑制由RIG-IN或MDA-5激活的IFN-β和ISRE报告基因活性。进一步的qPCR和Western blot实验也证实，NP和Gc能抑制RIG-IN或MDA-5诱导的IFN-α/β mRNA表达以及下游TBK1/IRF3的磷酸化。这些发现明确将NP/Gc的抑制功能定位在RLR通路上。
接下来，研究致力于寻找NP和Gc在RLR通路中的精确作用靶点。既然它们抑制了RIG-I和MDA-5的上游激活，研究人员探究了它们是否影响更下游的信号分子。双荧光素酶报告实验表明，NP和Gc不能抑制由线粒体抗病毒信号蛋白（Mitochondrial Antiviral Signaling Protein, MAVS）或其下游激酶TBK1过表达所激活的IFN-β启动子活性。这提示NP/Gc的作用位点在MAVS的上游，即RIG-I或MDA-5本身或其激活过程。然而，随后的免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）实验发现，NP和Gc蛋白并不能直接与RIG-I或MDA-5结合。这一矛盾结果引导研究者转向考虑调控RIG-I/MDA-5激活的关键E3泛素连接酶——三联基序蛋白25（Tripartite Motif Protein 25, TRIM25）。已知TRIM25通过对RIG-I和MDA-5进行K63连接的多聚泛素化修饰，对其激活至关重要。
研究的关键转折点在于使用了TRIM25基因敲除的细胞系（sg25细胞，由HepG2细胞通过CRISPR/Cas9技术构建）。在sg25细胞中重复上述报告基因实验时发现，当TRIM25缺失后，HTNV NP和Gc蛋白对RIG-IN诱导的IFN-β启动子活性的抑制能力完全消失了。同样，它们对IFN-α和IFIT1 mRNA表达的抑制作用也显著减弱。这直接证明了NP和Gc抑制IFN-I的功能是依赖于TRIM25的。进一步的分子机制研究通过Co-IP实验揭示：一方面，NP和Gc蛋白均能与TRIM25发生相互作用；另一方面，当NP或Gc存在时，会竞争性地削弱TRIM25与RIG-I或MDA-5之间的相互作用。这表明HTNV NP和Gc蛋白通过“劫持”TRIM25，干扰了TRIM25对RIG-I/MDA-5的正常泛素化修饰和激活，从而抑制了整个RLR信号通路的传导。
本研究的主要结果环环相扣，逻辑严密。转录组学分析提供了全局性线索，指向NP和Gc对干扰素通路的抑制。功能实验（qPCR、Western blot、免疫荧光）从表型上证实了这种抑制能力，并比较了NP与Gc的效力差异。报告基因实验将抑制作用精确定位到RLR通路，并排除了对MAVS和TBK1的直接影响。关键的遗传学证据（TRIM25敲除细胞实验）确立了TRIM25是NP/Gc发挥功能所必需的分子。最后的生化证据（Co-IP实验）阐明了具体的作用机制：NP/Gc通过与TRIM25结合，竞争性抑制了TRIM25与RLR受体（RIG-I/MDA-5）的相互作用。每一步的结果都为下一步的研究方向提供了依据和支持，最终共同指向了一个清晰的结论。
本研究的结论是：汉滩病毒（HTNV）通过其NP和Gc蛋白，靶向宿主细胞内的E3泛素连接酶TRIM25，竞争性抑制TRIM25与RIG-I/MDA-5的相互作用，从而阻断了RLR信号通路的正常激活，最终抑制了I型干扰素的产生。这揭示了HTNV逃逸宿主先天免疫的一种新机制。该研究具有重要的科学价值和应用价值。在科学层面，它首次系统地阐明了HTNV Gc蛋白在抑制干扰素应答中的作用，并发现NP和Gc蛋白共享同一靶点TRIM25，这深化了对汉坦病毒（尤其是致病性毒株）免疫逃逸策略复杂性的理解，为病毒与宿主相互作用的分子对话提供了新的见解。在应用层面，该研究鉴定出的关键病毒蛋白（NP、Gc）与宿主蛋白（TRIM25）的相互作用界面，可能成为未来开发新型抗病毒药物或治疗策略的潜在靶点。通过干扰这种相互作用，有可能恢复宿主的有效干扰素反应，从而控制病毒感染。
本研究的亮点在于：第一，研究发现的创新性：首次揭示了HTNV的Gc蛋白在抑制I型干扰素反应中的关键作用，并首次阐明HTNV通过其NP和Gc蛋白靶向TRIM25来抑制RLR通路的分子机制，这是一种新颖的免疫逃逸策略。第二，研究方法的系统性：采用了从全局到局部、从表型到机制的多层次研究策略，结合了转录组学（RNA-seq）、分子生物学（报告基因、qPCR、Western blot、Co-IP）、细胞生物学（免疫荧光）和遗传学（基因敲除细胞系）等多种技术手段，证据链完整有力。第三，研究对象的针对性：针对目前缺乏有效防治手段的严重传染病病原体HTNV，其研究具有明确的现实意义。第四，机制阐释的深度：不仅找到了作用靶点TRIM25，还通过竞争性结合实验阐明了其抑制作用的精确生化机制，即破坏TRIM25与RLR受体的功能性互作。这些发现为后续针对该通路的抗病毒干预研究奠定了坚实的理论基础。