本研究题为《高效农杆菌毛根介导的杨树转基因毛根不定芽再生技术》，由Wei Ming、Huang Ying、Zhang Hedan、Liu Yuqi、Zhao Ying、Zhang Mengqiu和Li Chenghao（通讯作者）共同完成。所有作者均来自中国哈尔滨的东北林业大学，隶属于林木遗传育种全国重点实验室和林业学院。该研究成果发表于学术期刊《Plant, Cell & Environment》，论文在线发表日期为2025年，具体刊载于2026年第49卷。

此项研究属于植物生物技术和林木遗传转化领域。其学术背景在于，杨树（Populus spp.）因其生长迅速、适应性强、木材用途广等优点，在工业用材、生态保护和城市绿化中扮演着重要角色。传统的农杆菌介导的杨树遗传转化（通常指根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的方法）依赖于外植体直接诱导不定芽，但存在效率低、假阳性率高、且严重依赖基因型等瓶颈问题。相比之下，发根农杆菌（A. rhizogenes）介导的毛根转化法通常具有更高的转化效率和更易于鉴别转化子的优势，尤其在与EYGFPuv这类荧光报告基因结合时更为便利。然而，尽管已有研究在苹果、猕猴桃等物种中利用叶片外植体成功建立了离体毛根诱导及植株再生体系，但在杨树中尚未建立一个高效、稳定的基于叶片外植体的发根农杆菌转化系统。此外，现有的一些利用茎段进行毛根转化的方法，常面临共培养后难以彻底除菌的难题。因此，本研究旨在开发一套适用于多种杨树物种、高效、快速且不依赖基因型的发根农杆菌介导的遗传转化体系，并结合根到芽的直接再生途径与实时荧光监测，最终将这一体系应用于CRISPR/Cas9基因组编辑，以加速杨树功能基因组学研究和分子育种进程。

研究的详细工作流程可以概括为以下几个核心步骤，每个步骤都包含了具体的研究对象、处理方法和实验设计： 首先，研究团队建立并验证了根到芽的再生基础。他们从四种杨树（大青杨P. ussuriensis、小黑杨Populus × xiaohei、84K杨Poplar 84K和“山新”杨“Shanxin” poplar）的离体植株上获取约3厘米长的根段作为外植体，将其培养在含有0.5 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA）和0.2 mg/L α-萘乙酸（NAA）的芽诱导培养基（SIM）上。实验结果显示，所有四种杨树的根段在培养2周后均观察到芽原基形成，4周内长出不定芽，再生效率达到100%。这一预备实验证实了所采用的根到芽诱导培养基在不同杨树物种中具有广泛的适用性，为后续从转基因毛根再生植株奠定了关键技术基础。

其次，研究以易转化的大青杨为模型，系统优化并建立了一套完整的发根农杆菌介导的毛根转化体系。该流程包括细菌培养、侵染悬浮液制备、外植体侵染、共培养、除菌、毛根诱导、荧光阳性毛根筛选、不定芽再生以及生根等环节。在优化过程中，研究团队进行了三组关键变量的比较实验。 1. 外植体类型比较：使用携带EYGFPuv报告基因的发根农杆菌K599菌株（菌液OD600=0.7），分别侵染大青杨的叶片、茎段和根段外植体。共培养并除菌后，外植体被转移到不含植物生长调节剂、但添加了100 μM乙酰丁香酮的半强度MS培养基（毛根诱导培养基）上。培养3周后，在365 nm紫外光照射下筛选发出强绿色荧光的EYGFPuv阳性毛根。结果表明，叶片外植体的阳性毛根诱导效率最高（32%），显著高于根段（10%）和茎段（6.67%）。 2. 农杆菌菌株比较：固定使用叶片外植体和OD600=0.7的菌液浓度，比较了K599、C58C1和MSU440三种携带EYGFPuv基因的发根农杆菌菌株的转化效率。结果显示，K599菌株的效率最高（35.91%），显著高于C58C1（14%），虽略高于MSU440（30.83%）但差异不显著。 3. 菌液密度比较：使用K599菌株和叶片外植体，测试了OD600为0.5、0.7和1.0的菌液密度。结果表明，在此OD值范围内，阳性毛根诱导效率没有显著差异，表明转化体系在该范围内表现稳健。 基于以上结果，研究确定了以大青杨叶片为外植体、使用发根农杆菌K599菌株、在OD600=0.7条件下进行侵染为最优转化组合。

随后，研究描述了从转基因毛根到完整植株再生的全过程。将长度超过2厘米的EYGFPuv阳性毛根转移到前述的芽诱导培养基（SIM）上。与普通根段直接出芽不同，毛根在SIM上培养2周后先诱导出愈伤组织，同时芽原基也在愈伤组织上出现。培养4周后，将已分化出芽原基的材料转移到含有0.8 mg/L 6-BA、0.02 mg/L NAA和0.5 mg/L赤霉素GA₃的芽伸长培养基上，再培养4周，促使多个芽从芽原基处伸长。将长度超过3厘米的伸长芽切下，转移到生根培养基中诱导生根。经过2周培养，根系发育健壮的再生转基因植株可进行继代培养，最终形成完整的转基因植株。整个流程从毛根诱导到获得转基因植株大约需要12周。研究特别指出，移栽到土壤中的转基因植株，在生长1个月和3个月后仍能保持清晰、强烈的荧光信号，证明了转基因表达的稳定性。此外，PCR分析使用EYGFPuv特异性和NPTII标记基因引物，对所有20株EYGFPuv阳性转基因植株进行了检测，均确认了外源基因的稳定整合。

为了验证该方法的普适性，研究将其应用于其他三种杨树：小黑杨、84K杨和“山新”杨。在小黑杨中，研究团队还将此前在大青杨中鉴定的一个调控不定根形成的关键基因PuHOX52克隆到EYGFPuv报告载体中，进行转化。利用建立的叶片圆盘转化法，小黑杨在3周内EYGFPuv阳性毛根诱导效率达到56.67%，高于大青杨，这可能源于物种间对转化的敏感性和组织培养反应的差异。通过根到芽培养，在12周内从单根毛根获得了超过100株EYGFPuv阳性离体植株。PCR和RT-qPCR均证实了转基因的稳定整合与表达，其中5个转基因株系中PuHOX52的表达量比野生型高出40倍以上。在84K杨和“山新”杨中，该方法在2周内即诱导出EYGFPuv阳性毛根，诱导效率分别为38.33%和30.83%，并在10周内成功获得了不定芽和完整植株。所有培养的EYGFPuv阳性毛根都产生了多个发出强绿色荧光的芽。这些结果充分证明了该转化方法对于不同杨树物种的适用性和高效性。

最后，为展示该体系在基因组编辑中的应用潜力，研究设计并实施了针对PuHOX52基因的CRISPR/Cas9编辑实验。研究人员设计了靶向PuHOX52的sgRNA，并将其克隆到携带EYGFPuv报告基因的pLB43载体中，然后导入发根农杆菌K599菌株。利用大青杨离体植株的叶片外植体进行转化，在3周内获得EYGFPuv阳性毛根，并诱导其分化出芽、再生为植株。对再生植株DNA的Sanger测序证实，在靶位点发生了精确的插入/缺失（Indels），包括双等位基因突变。再生得到的PuHOX52敲除突变体（PuHOX52-ko1）在生根10天后，与野生型相比，不定根的形成显著减少，其根系形态改变的表型与之前报道的PuHOX52-RNAi株系相似，证实了基因敲除导致了功能缺失。这一部分成功演示了该毛根介导的体系能够用于杨树快速、稳定的基因组编辑。

本研究的主要结果总结如下：1）成功建立并优化了一套以叶片为外植体、发根农杆菌K599菌株介导的高效杨树遗传转化体系，在大青杨中获得最高35.91%的阳性毛根诱导率。2）实现了从转基因毛根经愈伤组织和芽原基途径高效再生完整植株，整个过程约12周，再生植株移栽后转基因表达稳定。3）该体系被证明适用于小黑杨、84K杨和“山新”杨等多种杨树，其中小黑杨的阳性毛根诱导率高达56.67%，显示了良好的物种普适性。4）成功将该体系与CRISPR/Cas9技术结合，在大青杨中实现了对PuHOX52基因的高效编辑，并获得了预期表型的突变体植株，验证了其在功能基因组学研究中的应用价值。

研究的结论是，团队开发了一套快速、高效且适用范围广的发根农杆菌介导的杨树遗传转化系统。该系统融合了直接的根到芽再生途径和实时的EYGFPuv荧光监测技术，克服了传统根癌农杆菌方法的诸多局限，如显著降低了假阳性、无需抗生素筛选（在本体系中，筛选依赖于荧光报告基因）、且实现了不依赖基因型的高效转化。当与CRISPR/Cas9基因组编辑技术整合时，该体系为木本多年生植物的功能基因组学和遗传改良提供了一个强大的技术平台，有望加速杨树的分子育种进程。

本研究的亮点突出体现在以下几个方面：1）方法学创新：首次在杨树中建立了一套基于叶片外植体、高效且稳定的发根农杆菌介导的完整转化与再生体系，解决了此前该途径在杨树中未成功建立的难题。2）技术整合优势：将高效的毛根转化、可视化的荧光报告基因（EYGFPuv）筛选、以及根到芽的再生路径巧妙结合，形成了一个流程清晰、监控直观、周期相对较短的技术方案。3）强大的普适性：研究在四种亲缘关系不同的杨树物种中均验证成功，尤其是显著提高了难转化小黑杨等基因型的转化效率，打破了基因型依赖的壁垒。4）功能验证完备：不仅完成了转化流程的建立和优化，还进一步将体系成功应用于过表达（PuHOX52）和基因敲除（CRISPR/Cas9编辑PuHOX52）研究，充分证明了其在基础研究和基因工程应用中的实用价值。5）解决实际痛点：该体系通过荧光初筛降低了假阳性，通过高效的除菌和再生流程提高了成功率，针对传统杨树转基因的瓶颈问题提供了有效的解决方案。

这项研究提供了一项对于杨树乃至其他木本植物遗传转化和基因功能研究具有重要参考价值的技术突破。其建立的标准化流程、优化的条件参数以及展示的成功案例，为林业生物技术领域的科研人员提供了一个可靠且高效的工具，有助于推动林木复杂性状的解析和定向遗传改良。