骨髓器官芯片：高通量三维模型揭示造血干细胞动态与白血病细胞归巢
作者与发表信息 本研究由瑞士洛桑联邦理工学院（École Polytechnique Fédérale de Lausanne）的Matthias P. Lutolf教授团队主导，合作者包括来自瑞士日内瓦大学医院、苏黎世大学医院以及Sun Bioscience公司的研究人员。Sonja Giger和Moritz Hofer为共同第一作者。该研究成果以题为“Microarrayed human bone marrow organoids for modeling blood stem cell dynamics”的论文形式，于2022年7月8日在线发表在学术期刊《APL Bioengineering》上（卷6，文章号036101）。
学术背景 本研究属于组织工程、干细胞生物学和血液学交叉领域，聚焦于骨髓（Bone Marrow， BM）微环境的体外模拟。骨髓是造血干细胞/祖细胞（Hematopoietic Stem/Progenitor Cells， HSPCs）维持、分化和归巢的核心场所，其复杂的微环境（niche）由多种细胞（如间充质干细胞、内皮细胞、成骨细胞等）和信号分子构成。在急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia， AML）等血液疾病中，白血病干细胞（Leukemic Stem Cells， LSCs）对化疗的抵抗或移植的HSPCs未能成功归巢/定植（engraftment）是导致患者预后不良的关键因素。因此，深入理解HSPCs和LSCs在骨髓微环境中的行为至关重要。
传统的体内模型（如异种移植小鼠）存在伦理和技术限制，而现有的体外模型（如二维培养、基于支架或微流控芯片的系统）往往难以全面复现骨髓三维、多细胞相互作用的复杂生理环境。近年来，类器官（Organoid）技术为构建仿生组织模型提供了新思路，但针对骨髓的类器官模型仍非常有限。本研究旨在填补这一技术空白，开发一种能够高通量生成、高度重现骨髓关键结构和功能特征的三维骨髓类器官（Bone Marrow Organoid， BMO）模型，用于研究HSPCs的归巢行为以及白血病细胞的动态，并作为药物筛选和个性化医疗的临床前平台。
详细研究流程 本研究流程系统性地涵盖了BMO的构建、表征、功能验证及初步应用。
BMO的构建与表征
- 研究对象与样本量：研究使用人间充质干细胞（Mesenchymal Stem/Progenitor Cells， MSCs）和人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells， HUVECs）作为构建BMO的两种主要骨髓微环境细胞。实验测试了三种细胞比例：100% MSCs（100/0，对照组）、75% MSCs + 25% HUVECs（75/25）、50% MSCs + 50% HUVECs（50/50）。使用来自脐带血（Cord Blood， CB）的健康HSPCs以及从AML患者骨髓或外周血中分离的CD34+白血病母细胞（blasts）作为功能测试的“归巢”细胞。
- 实验方法与流程：
- 高通量形成：利用商业化的Gri3D微孔阵列平台（一种高密度、圆底的聚乙二醇水凝胶微孔板）进行BMO的高通量制备。将MSCs和HUVECs按设定比例混合后，接种到微孔中，细胞在重力作用下沉降并自聚集形成三维球状类器官。
- 生长与形态学分析：通过每日或隔日的明场显微镜成像，自动化脚本（基于Fiji/ImageJ）分析BMO的生长（面积）和均一性。每个条件分析300-1600个BMO。
- 表型与组织学表征：
- 免疫荧光染色：培养7天后，对BMO进行固定、透化、染色，使用共聚焦显微镜成像。标记物包括：间充质标志物（Endoglin/ENG, Nestin/NES, Transgelin/TAGLN）、内皮标志物（CD31, CD144）、造血细胞标志物（CD45）、增殖与凋亡标志物等。
- 流式细胞术：将BMO消化成单细胞悬液，通过流式细胞仪分析细胞表面标志物（如CD71, CD31, CD45, ENG, CD146, VEGFR等），以定量不同细胞群的比例和表型。
- 组织学染色：将BMO进行石蜡包埋切片或冷冻切片，进行苏木精-伊红（H&E）、油红O（脂滴）、阿利新蓝（酸性多糖）、茜素红（钙沉积）、天狼星红（胶原）、马休猩红蓝（纤维蛋白）等染色，分析细胞外基质成分和细胞分化状态。
- 内皮网络分析：对CD31免疫荧光图像进行三维重建和骨架化分析（使用Imaris软件及自定义脚本），量化内皮网络的体积、分支数量和连接点数量，评估其复杂性和稳定性。
BMO作为三维迁移/归巢 assays
- 研究对象：从脐带血中经谱系阴性选择（Lineage depletion）和/或CD34阳性分选富集的HSPCs，以及从AML患者样本中分选的CD34+白血病母细胞。
- 实验流程：
- 归巢实验：在BMO形成后第3天，将一定数量（62.5至750个）的HSPCs或白血病细胞接种到含有BMO的孔中。继续培养特定时间（4小时至96小时）后，收集BMO。
- 动态与机制研究：使用CFSE（羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯）对CD34+ HSPCs或白血病细胞进行预标记，以便追踪。在不同时间点固定BMO，通过免疫荧光（检测CFSE+细胞和CD31）和图像分析，定量归巢到BMO内部的细胞数量及其随时间变化的动力学。为了探究归巢机制，在接种前用CXCR4受体拮抗剂AMD3100或C3aR拮抗剂SB290157预处理HSPCs，或用抗多效生长因子（Pleiotrophin， PTN）抗体预处理BMO，然后评估其对归巢效率的影响。
- 空间定位分析：基于三维图像数据，使用自定义分析流程（通过MATLAB EasyXT和Imaris）计算归巢的HSPCs/白血病细胞到类器官表面（Do）和到内皮网络表面（Dn）的距离，分析它们在BMO内的空间分布偏好。
数据分析工作流程
- 图像分析：大量依赖自定义脚本进行自动化、定量化分析。例如，使用Fiji脚本自动检测明场图像中的BMO面积；使用Imaris进行三维表面渲染和斑点检测以识别类器官、内皮网络和归巢细胞；使用基于Fiji的脚本对骨架化的内皮网络进行架构参数提取；使用MATLAB EasyXT生成距离图并计算细胞到特定结构的平均距离。
- 统计分析：使用Student’s t检验比较两组数据，使用单因素方差分析（Ordinary one-way ANOVA）并进行多重比较分析多组数据。数据以均值、中位数、标准差或四分位数等形式展示，显著性水平设定为p < 0.05。
主要研究结果 1. BMO的成功构建与基本特性：研究成功在Gri3D平台上以高通量方式（每板近3000个）形成了均匀的BMO。共聚焦成像显示，在共培养条件（75/25， 50/50）下，CD31阳性的内皮细胞在MSCs基质中自组织形成了相互连接的管腔样网络结构，而纯MSCs对照组则无此结构。流式细胞术证实了内皮细胞（CD31+）的存在。BMO的体积生长与细胞起始比例相关，含内皮细胞的BMO尺寸更均一。
间充质区室的特征：免疫荧光和流式分析表明，与纯MSCs对照组相比，共培养BMO中表达ENG和CD146的自我更新型MSCs比例增加了30-50%。组织学染色显示BMO内存在胶原、纤维蛋白、糖胺聚糖等细胞外基质沉积，以及脂滴（油红O阳性，表明脂肪细胞分化）、SOX9（软骨形成标志）和RUNX2（成骨早期标志）的表达，但未检测到钙沉积（茜素红阴性）。这表明BMO中的MSCs既能维持干细胞特性，又能部分向脂肪细胞、软骨细胞和成骨前体细胞分化，模拟了天然骨髓中MSCs的多能性和分化平衡。
内皮网络结构的形成与量化：内皮细胞在MSCs存在下形成了复杂的三维网络。量化分析显示，75/25条件下形成的网络体积最大、分支和连接点最多，结构最复杂。该网络在培养的第4至6天保持稳定，第7天略有下降。内皮细胞特异性连接蛋白CD144的表达证实了细胞间连接的建立，而血管内皮生长因子受体（VEGFR）表达较低，提示活跃的出芽（sprouting）较少。
BMO支持HSPCs的归巢行为：
- 归巢效率：将HSPCs添加到BMO后，CD45+的HSPCs能够迁移并定植于BMO内部。重要的是，含有内皮网络的BMO（75/25和50/50）比纯MSCs的BMO吸引了显著更多的HSPCs，证明了内皮区室对HSPC归巢的促进作用。
- 剂量依赖性：归巢的HSPC数量与初始接种数量呈正相关。
- 空间分布：超过90%的归巢HSPCs位于距内皮网络表面10微米以内的区域，显著近于随机分布模型预测的平均距离，表明HSPCs倾向于紧邻内皮网络定居。大多数HSPCs迁移到了比均匀分布预期更深的位置。
- 归巢动力学：CFSE标记的CD34+ HSPCs在接种后8小时即可在BMO内检测到，其数量在24小时内持续增加，并在96小时内保持稳定。CFSE强度未出现减半的 bimodal分布，提示观察到的细胞数量增加主要源于迁移而非增殖。
- 归巢机制：部分HSPCs表达CXCR4受体，而BMO基质中广泛分布其配体CXCL12。用CXCR4拮抗剂AMD3100或C3aR拮抗剂SB290157预处理HSPCs，或用抗PTN抗体预处理BMO，均能在不同程度上减少归巢的HSPCs数量，其中SB290157处理组效果最明显（p=0.0523）。这证明HSPCs在BMO中的归巢行为部分依赖于CXCL12/CXCR4信号轴，模拟了体内的归巢机制。
BMO作为白血病细胞 niche的潜力：CFSE标记的CD34+ AML白血病母细胞在接种后仅4小时就能在BMO内检测到，并随时间推移持续迁移进入BMO，其CFSE强度在96小时内保持稳定，同样表明是迁移而非增殖。白血病细胞表达更高水平的CXCR4，这可能解释了其更快速的迁移能力。这证明BMO同样能够支持白血病细胞的归巢和定植，为在模拟骨髓微环境的背景下研究白血病提供了可能。
研究结论与意义 本研究成功开发了一种新型的、高通量的人源化三维骨髓类器官模型。该模型通过共培养MSCs和ECs，自组织形成了包含血管样网络和具有多向分化潜能的间充质区室的复杂结构，部分重现了骨髓微环境的细胞组成和空间特征。
- 科学价值：
- 模型创新：首次报道了一种基于细胞自聚集、无需外源支架或复杂微流控设计即可形成内皮化网络的骨髓类器官模型，简化了构建流程并提高了可扩展性。
- 机制验证：利用该模型，首次在体外三维多细胞环境中直观证实了内皮网络对HSPC归巢的关键促进作用，并揭示了其部分通过CXCL12/CXCR4等趋化因子通路介导，这与体内认知一致。
- 功能模拟：成功模拟了健康HSPCs和AML白血病母细胞向骨髓微环境的动态归巢过程，为研究生理和病理状态下的干细胞-微环境相互作用提供了强大工具。
- 应用价值：
- 药物研发平台：BMO系统可作为临床前模型，用于大规模化合物筛选、药代动力学和毒性研究，特别是针对影响HSPC归巢、白血病细胞存活或耐药性的药物。
- 疾病建模：为研究AML等血液疾病中白血病细胞与微环境的相互作用、耐药机制以及患者个体化治疗反应提供了新的体外测试体系。
- 替代动物实验：该人工系统有望减少对动物模型的依赖，降低研究成本和伦理约束。
研究亮点 1. 方法学创新：利用商业化的Gri3D微孔阵列平台，实现了骨髓类器官的高通量、标准化生产，每个24孔板可生成约3000个均一的BMO，满足了大规模筛选的需求。 2. 自组织与复杂性：仅使用两种主要骨髓细胞（MSCs和ECs），通过自聚集和自组织，形成了包含功能化内皮网络和具有特定分化状态的间充质基质的复杂三维结构，无需外加生物材料支架或复杂的工程化引导。 3. 功能验证深入：不仅进行了详细的表型表征，还深入研究了HSPCs和白血病细胞在其中的动态归巢行为、空间定位偏好以及潜在的分子机制（CXCL12/CXCR4轴），将模型结构与功能紧密联系。 4. 双重应用导向：模型同时适用于研究正常造血干细胞生物学（归巢、微环境相互作用）和血液系统疾病（白血病细胞定植），展示了其广泛的适用性。 5. 强大的定量分析：研究整合了先进的共聚焦成像、三维图像重建、骨架化分析和自定义算法，对类器官结构、网络形态和细胞行为进行了精细的量化，提供了坚实的数据支持。
其他有价值的内容 论文还讨论了模型的局限性（如长期培养中内皮网络的稳定性需优化）和未来发展方向，例如：进一步优化培养基以实现BMO的长期维持；添加更多类型的微环境细胞（如周细胞、成骨细胞、神经细胞）以增强模型的复杂性；分析BMO分泌的细胞因子谱以解析微环境与干细胞相互作用的分子基础；以及通过体内移植实验验证BMO中维持的HSPCs的功能。作者强调，该BMO系统在重现细胞间相互作用、研究归巢行为和干细胞维持方面比许多现有模型更接近天然骨髓，并因其可重复性和可扩展性，在基础研究和转化医学中具有巨大潜力。