学术报告：《Cell》期刊发表David R. Liu团队开发的紧凑高效Prime Editor新变体PE6
一、研究团队与发表信息
本研究由哈佛大学Broad研究所的David R. Liu团队主导，合作单位包括哈佛大学化学与化学生物学系、霍华德·休斯医学研究所以及明尼苏达大学医学院儿科系。主要作者包括Jordan L. Doman、Smriti Pandey、Monica E. Neugebauer等。研究于2023年8月31日发表于《Cell》期刊（Volume 186, Issue 18），标题为《Phage-assisted evolution and protein engineering yield compact, efficient prime editors》。
二、研究背景与目标
科学领域：本研究属于基因组编辑技术领域，聚焦于Prime Editing（PE，引物编辑）工具的优化。PE是一种无需双链断裂（DSB）即可实现精准基因组编辑的技术，由David R. Liu团队于2019年首次提出。
研究动机：尽管PE技术具有广泛的应用潜力，但其效率受限于逆转录酶（Reverse Transcriptase, RT）的活性与尺寸。现有PE系统（如PEMax）依赖体积较大的鼠白血病病毒逆转录酶（M-MLV RT），限制了体内递送（如AAV载体）的可行性。此外，不同编辑类型（如长片段插入或复杂结构编辑）对RT的适应性差异显著，亟需开发更高效且紧凑的编辑器变体。
研究目标：
1. 通过噬菌体辅助连续进化（Phage-Assisted Continuous Evolution, PACE）和蛋白质工程，开发尺寸更小、效率更高的PE变体；
2. 解析PE效率与引导RNA（pegRNA）二级结构的关系；
3. 实现体内长片段复杂编辑的高效递送。
三、研究流程与方法
1. RT酶筛选与工程
对象与方法：
- 筛选范围：测试了59种来自不同进化分支的RT酶，涵盖逆转录病毒、细菌反转录子等14个分类群（图1b）。
- 活性评估：在HEK293T细胞中对比野生型RT与工程化RT（如TF1、EC48）的编辑效率。
- 理性设计：基于AlphaFold2预测的RT结构，引入增强底物结合的突变（如TF1的K118R）。
关键结果：
- 野生型EC48 RT尺寸最小（1.2 kb），但编辑效率仅为PEMax的8%；
- 工程化五突变体TF1（RDTF1）在部分位点效率接近PEMax，但长片段编辑仍受限（图1g, 1i）。
2. 噬菌体辅助进化（PE-PACE）
创新方法：
- 电路设计：构建三种PACE电路（V1-V3），分别针对短插入（1 bp）、长插入（20 bp）和结构化pegRNA编辑（图2a, 2g）。
- 进化策略：通过RT或整PE蛋白的连续进化，富集高效突变（如V2电路下M-MLV RT的Q492stop截短突变）。
突破性发现：
- 进化产生的RT突变（如T128N、V223A）靠近聚合酶活性中心，显著提升长片段编辑的延伸性（图4b）；
- Cas9结构域进化揭示了编辑类型依赖性突变（如H721Y增强R-loop稳定性）。
3. PE6变体开发与验证
变体类型：
- PE6a：基于进化EC48 RT（EVOEC48），尺寸减少810 bp，效率达PEMax的80%（图3f）；
- PE6d：截短型M-MLV RT，在结构化pegRNA编辑中效率提升1.9倍（图4d）；
- PE6e-g：Cas9突变体（如K775R）针对特定位点提升效率1.8倍（图6d）。
关键技术：
- 二级结构预测：通过NUPACK量化pegRNA折叠自由能，指导RT选择（阈值ΔG < -23 kcal/mol时选用PE6d）（图4g）；
- UMI标记：用于校正大片段编辑（如100 bp插入）的PCR偏好性。
4. 体内递送验证
实验设计：通过双AAV系统递送PE6d至小鼠大脑皮层，测试42 bp loxP序列插入效率。
结果：
- 低剂量组：PE6d在转导细胞中编辑效率达17%，较PEMaxΔRNaseH提升23倍；
- 高剂量组：效率进一步提升至62%，且脱靶编辑未检出（图7c）。
四、研究结果与逻辑链条
1. RT工程与进化：通过结构引导突变和PACE，获得高效小尺寸RT（PE6a-b），解决AAV递送瓶颈；
2.processivity-编辑关系：发现RT延伸能力与pegRNA二级结构的拮抗效应（高processivity减少结构化模板的提前终止）（图4e）；
3. 模块化设计：Cas9与RT突变可独立组合（如PE6a/e），灵活适配不同编辑需求（图6e-f）。
关键数据支撑：
- PE6d在HEK3位点实现62%全长产物生成，而PEMaxΔRNaseH仅34%（图4e）；
- 短片段编辑中，PE6b将indel比率降低至PEMax的1/2（图5d）。
五、研究意义
科学价值：
1. 建立PE效率与RT特性（尺寸、processivity）的定量关系；
2. 揭示Cas9突变对PE的序列依赖性影响，拓展工具优化维度。
应用价值：
1. PE6a尺寸（1.2 kb）支持单AAV递送，PE6d实现体内62%长片段编辑（小鼠大脑）；
2. 为遗传病治疗（如 Tay-Sachs病、Bloom综合征）提供高效编辑方案（图5h）。
六、研究亮点
1. 方法论创新：首次将PACE应用于PE系统进化，实现RT与Cas9的并行优化；
2. 工具突破：PE6系列覆盖从最小尺寸（PE6a）到最高效长片段编辑（PE6d）的全谱需求；
3. 机制发现：解析pegRNA二级结构对编辑效率的调控作用，提出NUPACK预测指导原则。
七、其他价值
研究开发的PE-PACE平台可延展至其他Cas9或RT同源物优化，为下一代编辑器开发提供通用框架。此外，体内高效双AAV递送方案为神经系统疾病模型构建开辟新路径。
（全文完）
注：术语翻译对照
- Prime Editing (PE): 引物编辑
- Reverse Transcriptase (RT): 逆转录酶
- pegRNA: 引物编辑向导RNA
- Phage-Assisted Continuous Evolution (PACE): 噬菌体辅助连续进化
- NUPACK: 核酸二级结构预测工具
- Adeno-Associated Virus (AAV): 腺相关病毒