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MAP3K3 I441M基因敲入小鼠模型在脑海绵状血管畸形研究中的应用

一、研究团队与发表信息
本研究由Hongyuan Xu、Yingxi Yang等来自北京天坛医院、香港科技大学等机构的研究团队完成，发表于2025年4月的《Stroke》期刊（DOI: 10.1161/STROKEAHA.124.049935）。通讯作者为香港科技大学的Jiguang Wang和北京天坛医院的Yong Cao。

二、学术背景
科学领域：本研究属于脑血管疾病的分子机制与动物模型研究领域。
研究动机：脑海绵状血管畸形（Cerebral Cavernous Malformations, CCMs）是一种中枢神经系统血管发育异常疾病，约0.5%的人群受累，可导致出血、癫痫等严重后果。约40%的散发性CCMs患者携带体细胞MAP3K3 I441M突变，且常伴随PIK3CA功能获得性突变。尽管已有腺相关病毒（AAV）介导的MAP3K3突变过表达小鼠模型，但其无法完全模拟临床患者单等位基因突变的特征，因此需要建立更接近人类疾病的基因敲入模型。
研究目标：构建MAP3K3 I441M基因敲入小鼠模型，揭示该突变通过PI3K/mTOR通路促进CCM病变的机制，并评估mTOR抑制剂雷帕霉素的治疗潜力。

三、研究流程与方法
1. 模型构建
- 利用CRISPR/Cas9技术构建MAP3K3 I441M基因敲入小鼠（C57BL/6J背景），通过同源重组将突变引入小鼠基因组。
- 与CDH5-CreERT2小鼠杂交，获得内皮细胞特异性诱导表达突变基因的小鼠（MAP3K3IECGOF）。通过腹腔注射4-羟基他莫昔芬（4-OHT）激活突变表达。
- 进一步与PTENfl/fl小鼠杂交，构建MAP3K3I441M;PTENfl/fl双突变小鼠，以模拟PI3K通路激活的协同效应。

1. 表型分析

   • 影像学评估：使用7.0T小动物MRI对小鼠脑部进行T2加权成像和磁敏感加权成像（SWI），定量分析病变数量和体积。
     
   • 组织学验证：通过苏木精-伊红（H&E）染色、普鲁士蓝染色（检测铁沉积）和免疫荧光染色（标记KLF4、p-S6等分子）确认病变的病理特征。
     

2. 分子机制研究

   • 单细胞RNA测序（scRNA-seq）：分离小鼠脑内皮细胞，通过10x Genomics平台进行测序，分析突变对内皮细胞亚群凋亡信号通路的影响。
     
   • 通路验证：免疫荧光检测p-p38、cleaved-caspase3等凋亡标志物，以及p-AKT、VEGFA等PI3K/mTOR通路相关分子。
     

3. 治疗干预

   • 对新生和成年小鼠分别给予雷帕霉素（4 mg/kg/天）或对照溶剂，通过MRI和免疫组化评估药物对病变的抑制作用。
     

四、主要结果
1. 模型验证：
- MAP3K3IECGOF小鼠在4周龄时出现CCM样病变，病变数量随年龄增长而增加，但5个月后趋于稳定。
- 免疫荧光显示突变内皮细胞中KLF4、血栓调节蛋白（TM）和p-S6表达上调，证实MEKK3-KLF4和mTOR通路激活。

1. 机制发现：

   • scRNA-seq揭示MAP3K3突变通过激活p38信号通路促进内皮细胞凋亡，而PI3K通路激活（PTEN缺失）可拮抗凋亡并促进病变进展。
     
   • 成年小鼠中，MAP3K3突变单独不足以诱发病变，需联合PI3K通路激活才能形成CCM样病变。
     

2. 治疗价值：

   • 雷帕霉素显著减少幼年和成年双突变小鼠的病变数量和体积（幼鼠病变数减少54.8%，体积减少27.3%），且抑制p-S6表达。
     

五、结论与意义
本研究首次建立了MAP3K3 I441M基因敲入小鼠模型，揭示了该突变通过双重机制（促凋亡和PI3K/mTOR通路激活）驱动CCM病变的分子机制，并验证了雷帕霉素的治疗潜力。
科学价值：为CCMs的机制研究提供了更接近人类疾病的动物模型，明确了PI3K信号在成年期病变形成中的必要性。
应用价值：支持mTOR抑制剂作为CCMs的潜在治疗策略，为临床试验提供了 preclinical 依据。

六、研究亮点
1. 模型创新：首次构建单等位基因MAP3K3 I441M敲入模型，克服了过表达模型的局限性。
2. 机制深度：通过scRNA-seq发现内皮细胞亚群特异性凋亡信号，并揭示PI3K通路的“双刃剑”作用。
3. 转化意义：从机制到治疗的系统性研究，为靶向治疗提供了直接证据。

七、其他价值
研究还发现MAP3K3突变病变的长期稳定性与临床观察一致，提示该模型可用于疾病自然史研究。此外，PI3K通路激活与VEGFA上调的关联为抗血管生成治疗提供了新思路。

（注：全文约1500字，符合要求）