《Journal of Neuroinflammation》| 易浩彤、胡梦妍等 | 2025年 中山大学附属第三医院神经内科

研究背景

急性缺血性脑卒中（Acute Ischemic Stroke, AIS）是全球致死和致残的主要原因之一。在卒中急性期，机体会激活交感神经系统（SNS）和下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴），主动诱导一种免疫抑制状态，以减轻因血脑屏障破坏引发的过度神经炎症损伤。然而，这种代偿性反应如同一把双刃剑，在保护大脑的同时，也导致外周血淋巴细胞大量减少，引发所谓的“卒中后免疫抑制”（Post-Stroke Immunosuppression, PICS）。PICS会显著增加患者对卒中相关性感染（SAIs）的易感性，进一步加剧神经功能缺损和死亡率。目前临床上针对SNS/HPA轴的干预策略面临两难困境：抑制这些通路虽可缓解免疫抑制，却可能干扰机体内源性的神经保护机制，使治疗捉襟见肘。

骨髓间充质干细胞（BM-MSC）因其强大的免疫调节和旁分泌能力，在卒中治疗中展现出减少脑梗死体积和感染风险的潜力。然而，此前的研究多集中于外周免疫器官，如脾脏和肺部。胸腺作为T细胞发育和成熟的中枢免疫器官，在卒中后会因SNS/HPA轴的过度激活而发生严重萎缩，导致T细胞输出锐减，此核心环节的修复机制一直未被探索。因此，如何在不牺牲神经保护的前提下，修复胸腺损伤、重建T细胞发育微环境，成为了卒中免疫治疗领域的关键空白。基于此，研究团队推测BM-MSC可能通过某种未知机制修复卒中后的胸腺萎缩，从而缓解外周免疫抑制。

研究流程与方法

为验证上述假说，该研究设计了一套从动物模型、细胞生物学到分子机制的多层次研究流程。

第一步，验证BM-MSC对卒中后胸腺萎缩的治疗效果。研究选用8周龄雄性C57BL/6小鼠，通过60分钟短暂性大脑中动脉阻塞（tMCAO）模型模拟AIS，在再灌注2小时后经静脉注射BM-MSC（2×10⁶个/只）或安慰剂。在术后第1、3、5、7、14天动态监测胸腺指数（胸腺湿重/体重），并在第7天通过H&E染色、免疫荧光（标记皮质标志物CK8和髓质标志物CK5）和流式细胞术分析胸腺结构、胸腺上皮细胞（TEC）亚群比例及T细胞分化情况。同时，通过ELISA检测血浆胸腺肽（Tα1, Tβ4, Tβ10）及炎症标志物水平，全面评估BM-MSC对中枢免疫稳态和全身炎症的恢复作用。

第二步，探究BM-MSC修复胸腺的机制。对术后第7天的胸腺组织进行批量RNA测序（Bulk RNA-Seq），通过差异表达基因分析和GO富集分析锁定关键生物学过程。随后，利用免疫印迹、流式细胞术的Ki67/DAPI共染和免疫荧光，精确描绘髓质胸腺上皮细胞（mTEC）和皮质胸腺上皮细胞（cTEC）的细胞周期和增殖变化。为明确BM-MSC是否直接进入胸腺，研究者将GFP标记的BM-MSC移植入小鼠体内，观察其在胸腺中的定位。

第三步，发现并证明迁移体（Migrasomes）作为核心效应器的关键作用。在观察到BM-MSC无法穿越血-胸腺屏障（BTB）后，研究者从胸腺组织中分离并鉴定了大小在500-3000nm、具有典型“收缩纤维”和“内部囊泡”结构的迁移体。为追踪其去向，他们使用WGA标记BM-MSC，并在体内外验证了Tspan4-GFP标记的迁移体是否能被TEC特异性摄取。关键的“功能丧失”实验是，使用肌球蛋白抑制剂Blebbistatin或敲低Tspan4来抑制BM-MSC产生迁移体，观察其治疗效应是否消失；再通过“功能回补”实验，将野生型迁移体与Tspan4敲低的BM-MSC共同注射，观察是否挽救治疗效果。

第四步，解析BM-MSC来源的迁移体驱动胸腺修复的分子机制。研究团队利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学对迁移体的蛋白货物进行了全面鉴定，聚焦到细胞周期关键调节因子Pin1。之后，通过构建Pin1敲低（Pin1KD）和过表达（Pin1OE）的BM-MSC细胞系，结合体外Transwell共培养体系（BM-MSC与TEC非接触共培养）和体内tMCAO模型，从“必要性”和“充分性”两个维度验证Pin1作为核心功能蛋白是否能介导迁移体促mTEC增殖的效应。此外，研究还利用单细胞RNA测序（scRNA-Seq）在单细胞水平解析了治疗前后胸腺细胞亚群的变化，尤其是揭示了mTEC I亚群的关键响应作用。

主要研究结果

研究结果系统性地证实了BM-MSC来源的迁移体通过递送Pin1逆转胸腺萎缩的新机制。

首先，BM-MSC移植显著逆转了卒中诱发的胸腺萎缩，表现为胸腺指数更快恢复。组织学分析显示，BM-MSC治疗重建了胸腺皮质-髓质结构，恢复了CK8+/CK5+的细胞比例平衡。功能上，血浆中具有免疫调节功能的胸腺肽Tα1和Tβ4水平显著升高，而炎症标志物CRP、LBP和LPS水平降低。流式分析证实，BM-MSC治疗增加了mTEC和cTEC的比例，以及MHC II+和AIRE+的成熟功能亚群，最终促进了胸腺内T细胞的再生，表现为双阳性T细胞比例和数量的增加。

其次，机制研究揭示了mTEC是BM-MSC作用的关键靶点。Bulk RNA-Seq数据显示，BM-MSC治疗组胸腺中细胞增殖和核分裂相关通路被显著富集。细胞周期分析确证，BM-MSC主要促进mTEC从G0期进入S期和G2/M期，而对cTEC影响不显著。关键的影像学证据表明，绝大多数GFP-BM-MSC滞留于胸腺的血管内，并未穿越血-胸腺屏障，这意味着其修复作用依赖于其分泌的外泌体囊泡。

再次，研究明确了迁移体是发挥治疗作用的必要且充分的组件。从胸腺组织中分离出的囊泡在大小和形态上均符合迁移体特征。直接注射Tspan4-GFP标记的迁移体发现，它们能穿过BTB并在胸腺髓质大量富集，特异性地被mTEC和cTEC摄取，而非免疫细胞。迁移体单药治疗几乎完美复刻了BM-MSC的所有治疗效果，包括逆转胸腺萎缩、恢复结构和功能、促进T细胞再生以及改善神经功能评分。反之，无论是用Blebbistatin处理还是Tspan4敲低的BM-MSC，均完全丧失了对胸腺的修复能力；而给Tspan4敲低的BM-MSC补充外源性迁移体后，其疗效又被完全“挽救”，有力地证明了迁移体是BM-MSC发挥胸腺修复作用的决定性介质。

然后，分子机制研究锁定了核心货物蛋白Pin1。蛋白质组学分析鉴定出细胞周期调节因子Pin1是迁移体中的重要货物。体外Transwell和体内实验均证实，BM-MSC分泌的WGA+迁移体携带Pin1蛋白，并可被TEC内化。在氢化可的松诱导的TEC衰老模型中，与正常BM-MSC共培养或加入其迁移体均可显著提升TEC的增殖能力，而Pin1敲低BM-MSC的迁移体则完全丧失此功能；更重要的是，Pin1过表达（Pin1OE）的迁移体展现出更强的促增殖能力，直接证明了Pin1的充分性。体内实验同样显示，Pin1KD-BM-MSC或其它迁移体治疗无法修复tMCAO小鼠的胸腺结构，而Pin1OE-迁移体则能显著恢复胸腺指数和皮质-髓质结构。

最后，scRNA-Seq在单细胞层面提供了高分辨率的解释。分析发现，治疗主要导致mTEC I亚群的显著扩增，该亚群处于发育轨迹的起点，具有向mTEC II和cTEC分化的潜力，从而整体上重建了胸腺上皮细胞的稳态和功能。

研究结论及价值

本研究首次揭示了一种全新的卒中后免疫治疗机制：BM-MSC通过分泌迁移体，作为一种“无细胞”的载体，穿越血-胸腺屏障，将关键的细胞周期调控蛋白Pin1精准递送至髓质胸腺上皮细胞，促进其增殖，从而逆转胸腺萎缩，重建T细胞发育微环境，最终缓解外周免疫抑制。该发现不仅阐明了干细胞治疗中枢免疫器官的新模式，更开创性地提出了一种能同时实现神经保护和免疫恢复双重功效的“无细胞”治疗策略，有效解决了当前卒中免疫治疗中“神经保护”与“免疫抑制缓解”难以调和的临床核心难题。迁移体作为一种可量产和标准化的制剂，规避了活细胞移植的伦理顾虑和潜在安全风险，具有重大的临床转化潜力。

研究亮点

本研究的亮点在于其突破性的机制创新和临床转化价值。其一，首次揭示了BM-MSC通过释放迁移体跨越血-胸腺屏障的独特运输方式，为理解干细胞如何调控中枢免疫器官提供了全新视角。其二，将迁移体从中风的病理研究领域拓展到了组织再生和免疫修复的治疗领域，并证明其单药即可发挥干细胞的双重治疗益处。其三，通过“功能丧失”和“功能回补”的严谨实验设计，无可辩驳地证明了迁移体是BM-MSC修复胸腺所必需的，建立起明确的因果逻辑链。其四，鉴定出核定位蛋白Pin1作为迁移体介导增殖效应的核心效应分子，揭示了迁移体可直接递送细胞周期调控子来驱动靶细胞增殖的新范式，这一点区别于传统的生长因子或趋化因子信号。最后，该研究提出的“无细胞”迁移体疗法，为心脑血管疾病和其他涉及免疫衰老疾病的免疫治疗开辟了广阔的新方向。