本研究由美国加州大学伯克利分校创新基因组研究所、霍华德·休斯医学研究所、分子与细胞生物学系等多个机构的Noam Prywes、Naiya R. Phillips、Luke M. Oltrogge等多名研究人员共同完成，通讯作者为David F. Savage。该项研究成果以“A map of the rubisco biochemical landscape”为题，于2025年2月20日发表在顶级学术期刊 Nature 上。

该研究属于合成生物学、蛋白质工程与酶学交叉领域。核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，简称Rubisco）是地球上最丰富、也是驱动生物圈初级碳固定的核心酶。然而，其催化效率（kcat）低下，且存在与氧气的副反应，这被认为是限制光合作用效率的关键瓶颈之一。尽管过去数十年间，研究人员试图通过工程化改造来改善Rubisco的动力学参数（如CO₂亲和力Kc和催化速率kcat），但成效有限，主要障碍在于传统生化测量方法通量极低，难以系统探索Rubisco庞大的序列-功能空间。因此，全面绘制Rubisco的生化参数图谱，理解其进化约束和功能可塑性，对于指导理性设计、提升作物光合效率具有重大科学意义。本研究的核心目标是：开发一种高通量方法，系统性地绘制模式II型Rubisco（来自Rhodospirillum rubrum）几乎所有单氨基酸突变的序列-功能图谱，并从中推断出关键动力学参数，以探索其功能优化的潜在路径。

研究的详细工作流程可以概括为以下几个关键步骤： 首先，构建Rubisco依赖型筛选系统。 研究人员基于先前的工作，使用了一株工程化改造的大肠杆菌（Escherichia coli）菌株δRpi。该菌株的核糖-5-磷酸异构酶基因被敲除，导致当其以甘油为唯一碳源生长时，会积累核酮糖-5-磷酸，造成生长停滞。只有在同时表达磷酸核酮糖激酶（PRK，用于生成Rubisco底物RuBP）和功能性Rubisco时，Rubisco才能将RuBP固定CO₂转化为3-磷酸甘油酸，重新进入中心碳代谢，从而“拯救”菌株生长。研究人员验证了该菌株的生长速率与Rubisco酶活性（包括酶浓度和CO₂浓度）呈正相关，且生长速率与已知突变体的体外催化速率（kcat）线性相关，证实了该系统可用于高通量、定量地表征Rubisco变体的羧化功能。 其次，构建全覆盖的单氨基酸突变体文库并进行深度突变扫描。 研究对象是来自R. rubrum的模型II型Rubisco（由466个氨基酸组成的大亚基同源二聚体）。研究团队设计并合成了一个覆盖该蛋白几乎所有（99%以上，共8,760个）可能单氨基酸替换的突变体文库。文库构建采用分段寡核苷酸库合成与Golden Gate组装策略，将Rubisco基因分为11个片段，分别合成包含所有单点突变的寡核苷酸池，再组装成完整基因。随后，将这些突变基因克隆至一个带有独特条形码（barcode）的筛选质粒中，该质粒同时包含诱导型表达的PRK和Rubisco基因。通过大规模转化和测序，最终获得了包含约18万个条形码、代表8,760个突变体的高复杂度文库。将该文库转化至δRpi菌株后，在含有甘油和5% CO₂（对应溶液中约1,200 μM CO₂）的选择性培养基中进行培养（约7个世代）。通过高通量测序比较筛选前后各条形码（即各突变体）的相对丰度变化，计算出每个突变体的“适应度”（fitness）。该适应度反映了该突变体Rubisco支持细胞生长的能力，与酶的催化通量直接相关。九次生物学重复实验显示出高度一致性（平均皮尔逊相关系数0.98），证明了数据的可靠性。 第三，通过CO₂浓度滴定推断酶动力学参数。 这是本研究的创新核心。为了超越简单的“适应度”测量，并分解出具体的生化参数（最大反应速度Vmax和CO₂亲和力Kc），研究团队对突变体文库进行了CO₂浓度梯度下的平行筛选实验。他们在多个不同的CO₂浓度环境下重复了上述深度突变扫描过程。基于生长速率与酶促反应速率成正比的假设，他们将每个突变体在不同CO₂浓度下的适应度数据拟合到米氏方程模型中。通过非线性最小二乘拟合，为每个突变体推断出两个关键参数：相对于野生型的最大速度比值（∼Vmax）和表观CO₂半饱和常数（K̃c）。为了评估参数估计的可靠性，他们进行了大规模的参数自举分析，最终对65%的突变体（5,687个）获得了变异系数小于1的可靠K̃c估计值。 第四，体外生化验证与深入表征。 为了验证体内筛选推断出的参数准确性，并深入理解关键突变体的生化特性，研究人员从文库中选取了一系列具有不同预测K̃c值的突变体进行纯化，并利用分光光度法、放射性碳（¹⁴C）固定法和膜进样质谱法（MIMS）等传统生化手段，精确测量了它们的催化速率（kcat）、CO₂亲和力（Kc）、对RuBP的米氏常数（Km,RuBP）以及CO₂/O₂特异性（Sc/o）。特别关注了那些在筛选中显示出异常高CO₂亲和力（低K̃c）的突变位点。

研究取得了一系列重要结果： 首先，获得了近乎完整的Rubisco单点突变适应度图谱。 研究测量了超过99%的可能单氨基酸替换的适应度，发现绝大多数突变（72%）是有害的，极少有突变（<0.14%）表现出优于野生型的适应度，且优势非常微弱。这些微弱优势后来被证明主要与蛋白质表达水平提高有关，而非kcat的提升。适应度在蛋白质结构上的分布符合预期：溶剂暴露区域耐受性高，活性位点和埋藏残基耐受性低。一个有趣的发现是，尽管系统发育保守性与位点的平均突变耐受性总体呈负相关，但仍存在一些高度保守却对突变高度耐受的位点（如G186），以及一些保守性低但突变耐受性也低的位点，后者可能暗示了新近进化出的关键功能。 其次，通过CO₂滴定成功推断了数千个突变体的动力学参数。 研究获得了5,687个突变体的可靠K̃c和∼Vmax估计值。分析发现，∼Vmax是驱动适应度的主要因素（与适应度相关系数r=0.93）。更重要的是，对于具有近野生型动力学的变体，∼Vmax和K̃c之间存在明显的反相关关系，即大多数单点突变在损害CO₂亲和力的同时，也降低了最大反应速度。这表明在缺乏定向选择压力的情况下，酶的功能参数倾向于协同退化。 第三，发现了能显著提高CO₂亲和力的罕见突变。 筛选鉴定出少数几个能大幅改善CO₂亲和力的单点突变，包括A102Y、V266T、A289C和A289T。其中，A102Y和V266T的体外验证证实了其Kc值显著降低（即亲和力提高），分别达到约80 μM和90 μM CO₂，相较于野生型的~150 μM CO₂有显著提升。这些突变位点并不位于已知的活性中心，而是位于同源二聚体界面靠近C2对称轴的区域。这是首次在细菌II型Rubisco中通过单点突变获得如此高的CO₂亲和力，其数值更接近通常在植物和藻类I型Rubisco中观察到的范围。 第四，揭示了功能参数间的潜在权衡。 对A102Y和V266T的深入生化表征显示，它们提高CO₂亲和力的“代价”是催化速率（kcat）的成比例下降，而其对氧气的特异性（Sc/o）并未发生显著改变。这一发现支持了Rubisco催化机制中可能存在“速率-亲和力权衡”的假说。这些突变体的功能坐标（kcat vs. Kc）将细菌II型Rubisco的功能边界向外拓展，甚至部分覆盖了与植物/藻类I型Rubisco之间的功能间隙。

本研究的结论是：通过开发一种将酶活性与细胞生长耦合的高通量、平行化筛选策略，并结合底物浓度滴定，成功绘制了Rubisco近乎完整的生化景观图谱。该图谱揭示，虽然绝大多数突变对功能有害，且酶的功能参数（Vmax与Kc）通常协同变化，但非平凡的生化改变——特别是显著提升CO₂亲和力——通过单点突变即可实现，尽管较为罕见。这些高亲和力突变体的发现表明，不同生物来源的Rubisco（如细菌II型与植物I型）之间的功能距离是可以被跨越的。这为理解Rubisco的进化约束和后续的酶工程改造奠定了坚实的基础。

本研究的亮点和价值在于：1. 方法学创新： 首创了将深度突变扫描与底物滴定相结合的高通量酶动力学参数推断方法，极大提升了获取蛋白质序列-功能关系数据的效率和维度，为酶工程和机器学习指导的蛋白质设计提供了强大的数据生成平台。2. 数据集的规模和系统性： 获得了迄今为止对单个酶最全面的单点突变功能图谱之一，包括适应度和推断的动力学参数，构成了一个极其宝贵的资源库。3. 重要科学发现： 不仅验证了Rubisco关键位点的敏感性，还意外发现了能将其CO₂亲和力提升至类植物水平的单个突变，挑战了人们对II型Rubisco功能可塑性的传统认知，并直接为“速率-亲和力权衡”假说提供了实验证据。4. 应用前景： 该研究建立的筛选体系（δRpi）和策略为后续探索更高阶突变组合、挖掘自然界未开发的Rubisco多样性、乃至工程化设计具有更优光合性能的Rubisco变体铺平了道路，最终可能助力于作物光合效率的遗传改良。

此外，研究也指出了当前工作的局限和未来方向，例如未能完全扣除蛋白质表达水平差异对∼Vmax的影响，以及尚未系统评估突变对氧气副反应（特异性）的影响。未来通过结合氧气浓度滴定和更精确的表达定量，可以进一步丰富Rubisco的生化景观图谱，并更全面地揭示其催化机制中的各种权衡关系。