本研究由复旦大学的徐志芳、陈莹、孟希、王福江和郑志坚等学者完成，其所属机构为复旦大学环境科学与工程系及上海市大气颗粒物污染与防治重点实验室（Shanghai Key Laboratory of Atmospheric Particle Pollution Prevention, Department of Environmental Science & Engineering, Fudan University）。该研究成果于2015年11月30日在线发表于《欧洲藻类学期刊》（European Journal of Phycology），并于2016年正式刊出在第51卷第1期，页码为107至118。
东海（East China Sea, ECS）是全球最大的边缘海之一，作为大气二氧化碳的净碳汇，在区域碳循环中扮演关键角色。其沿岸水域水文环境复杂，强烈受控于长江冲淡水（Yangtze River Diluted Water, YDW）、台湾暖流（Taiwan Warm Current, TWC）以及黑潮（Kuroshio Current）等多重水团影响。长江径流作为硝酸盐和硅酸盐的主要来源，其季节性变化与台湾暖流的入侵共同塑造了该海域独特的营养盐动态格局。然而，近年来东海沿岸有害藻华（Harmful Algal Blooms, HABs）事件频发，且甲藻（dinoflagellates）在浮游植物群落中的比例从上世纪80年代的不足5%显著上升至2010年代的约20%，这一群落结构演变引起了广泛关注。
传统上，对东海浮游植物多样性的研究多依赖显微镜检（microscopy），该方法虽积累了包括67个优势种在内的长期数据，证实了硅藻（diatoms）尤其是骨条藻属（Skeletonema）的全年优势地位，但在鉴定个体微小的微微型浮游生物（picoplankton）时存在局限，且要求研究者具备丰富的分类学经验。分子生物学方法，作为克服这些局限的潜力工具，在该海域的应用仍十分有限。在遗传标记选择上，尽管18S rRNA基因应用广泛，但核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基基因（rbcL基因）因其位于质体（plastid）中，能特异性靶向光合自养生物（photosynthetic plankton）而排除异养类群，且进化速率更快，更适于近缘物种的系统发育分析。因此，本研究旨在运用rbcL基因分子标记，揭示长江口邻近东海沿岸海域浮游植物的优势类群及其季节性演替规律，并特别关注检测可能引发有害藻华的物种，为理解该海域生态系统的变化提供分子层面的证据。
本研究的工作流程可系统性地划分为现场样品采集、DNA提取、克隆与测序，以及数据分析四个主要环节。
1. 样品采集 研究区域位于东海沿岸的花鸟岛附近（30.85°N, 122.67°E）海域。为捕捉季节性变化，科学家在2012年4月至2013年11月期间，分春、夏、秋、冬四个季节进行了表层海水（surface seawater）采集。每个季节包含两个采样时段，每个采样日在上午10点至下午2点间采集2至3个样品，共计获得111个离散样品。每次采集1升海水，首先用50微米孔径的尼龙网预过滤以去除浮游动物等大型摄食者（grazers），随后使用0.22微米孔径的混合纤维滤膜收集浮游植物。滤膜被密封于培养皿中，并在-20°C下冷冻保存，以备后续核酸提取。同时，研究团队还记录了包括云量（cloud cover，作为光照强度的替代指标）、降水量（precipitation）、海水盐度（salinity）和温度（seawater temperature）在内的环境因子数据。
2. DNA提取与PCR扩增 在实验室中，采用改良的CTAB法从滤膜上提取总基因组DNA。流程为：将滤膜剪碎后置于CTAB缓冲液中，加入玻璃珠进行物理破碎，随后经过65°C水浴、氯仿/异戊醇抽提、酚/氯仿/异戊醇再次抽提、异丙醇沉淀、乙醇洗涤等步骤，最终将获得的DNA沉淀溶解于双蒸水中。这是该流程中的一个关键预处理步骤。
为全面覆盖不同浮游植物类群，研究选用了两对特异性引物，分别扩增rbcL基因的IAB型和ID型（Rubisco Form IAB and Form ID）片段。选择这两对引物是基于它们不同的靶向范围：IAB型引物主要捕获蓝藻（cyanobacteria）、绿藻（chlorophyta）和变形菌（proteobacteria）；而ID型引物则针对硅藻（bacillariophyta）、甲藻（pyrrophyta）、隐藻（cryptophyta）和定鞭藻（haptophyta）。PCR扩增使用Ex Taq试剂盒，50微升反应体系包含特定引物、模板DNA及牛血清白蛋白等，反应程序包括94°C预变性、40个温度循环及72°C最终延伸。扩增产物经凝胶电泳纯化后，同一天的平行样品被混合在一起。
3. 克隆与测序 纯化后的PCR产物被克隆至pMD18-T载体中，并转化入DH5α感受态细胞。研究对四个季节共分析了1232个克隆（每个季节123至180个不等），其中包括IAB型rbcL克隆587个，ID型rbcL克隆645个，这些克隆最终进行Sanger法测序获取核苷酸序列。
4. 数据分析 数据分析流程系统而严谨。首先，在NCBI数据库中，利用BLAST算法比对去除载体序列后的克隆序列，以鉴定最相近的物种。相似度低于93%的序列被定义为“未培养微生物”。其次，利用PHYLIP和DOTUR软件，以96%的序列相似度为阈值，将序列划分为不同的操作分类单元（Operational Taxonomic Units, OTUs）。基于OTU数据，计算了香农多样性指数（Shannon Index）、Chao1丰富度估计量以及文库覆盖率（library coverage）等生态学指标。为了解浮游植物群落结构，还采用邻接法（Neighbor-joining method）在MEGA 5.0软件中构建了系统发育树（phylogenetic tree）。最后，为揭示驱动群落结构变化的环境因子，研究采用了典范对应分析（Canonical Correspondence Analysis, CCA），将各季节OTUs的百分比数据与海水温度、盐度、云量和降水量进行关联。
1. 浮游植物多样性及其季节性差异 研究结果揭示了东海沿岸浮游植物多样性的显著季节性模式。基于IAB型和ID型rbcL克隆文库的分析一致显示，秋季的香农多样性指数最高（IAB型为3.1，ID型为3.4），表明该季节浮游植物多样性最为丰富；而夏季的多样性指数最低（IAB型为2.4，ID型为2.6）。值得注意的是，尽管冬季ID型rbcL的Chao1指数（122）几乎为春季（64）的两倍，暗示其更高的分类单元丰富度，但其香农指数（2.5）却低于春季（2.8）。这一矛盾表明，春季群落的均匀度（evenness）很高，各OTU比例分配均匀；而冬季群落则由极少数优势类群主导，这从最终结论中也能得到印证——冬季49%的克隆均属于Fortii鳍藻（Dinophysis fortii）。
2. 基于IAB型rbcL的群落结构：绿藻的绝对优势 通过IAB型rbcL标记鉴定的类群中，绿藻门（Chlorophyta）在全年的丰度均远超蓝藻门（Cyanobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）。其物种组成存在明显的季节更替。 - 春季：优势种为Prasinos绿藻（Bathycoccus prasinos），占该季总克隆数的18%；其次是硝酸盐还原甲基菌（Methylophaga nitratireducenticrescens，一种γ-变形菌），占15%；以及蓝藻拟色球藻属（Chroococcidiopsis sp.），占14%。 - 夏、秋、冬季：优势种则转变为微单胞藻属（Micromonas sp. RCC299）。其在夏季、秋季和冬季的占比分别高达44%、42%和17%，显示出其作为广温性物种对该海域环境的极强适应性，与全球其他温带水域的发现一致。 系统发育树进一步揭示了IAB型克隆主要聚类在绿藻纲（Mamiellophyceae）和γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）。γ-变形菌在寒冷季节（春、冬季）丰度更高，而α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）则在夏季占据变形菌内部的主导地位，这与其他海域观测到的细菌群落演替规律相符。
3. 基于ID型rbcL的群落结构：硅藻与甲藻的季节演替 ID型rbcL标记的分析结果揭示了硅藻和甲藻之间鲜明的季节交替主导现象。 - 系统发育树结构：在系统发育树中，中心硅藻纲（Coscinodiscophyceae）构成了最大的分支，拥有最多的克隆数，其中骨条藻属（Skeletonema）和海链藻属（Thalassiosira）是主要成员。 - 春、冬季优势种：Fortii鳍藻（Dinophysis fortii） 在这两个季节成为最丰富的物种，尤其是在冬季，其单独占据了52%的ID型克隆。这与近年来东海甲藻比例增加的宏观趋势高度吻合。 - 夏、秋季优势种：硅藻中的骨条藻属重新占据主导。夏季最优势种为中肋骨条藻（Skeletonema costatum），占24%；秋季则被近盐骨条藻（Skeletonema subsalsum） 取代，占13%。 该结果与前人数十年的显微镜检结论一致，即骨条藻是东海全年的关键类群，但本研究在分子层面精准揭示了其种间（中肋骨条藻与近盐骨条藻）的季节性替代。
4. 环境驱动因子分析 典范对应分析（CCA）解析了环境因子与浮游植物群落结构的关系。海水温度是驱动群落季节性分布的首要因子，与CCA第一轴呈强正相关（系数0.9229）。 - 夏季和秋季的水样与温度呈正相关，而冬季和春季则呈负相关。 - 具体到物种，苏伊士四爿藻（Tetraselmis suecica） 和五角多甲藻（Peridinium quinquecorne） 与高温条件正相关，成为夏季的特有优势种。微小海链藻（Thalassiosira minima） 同样喜高温，并与盐度呈强负相关，表明其丰度可能随夏季长江径流增加、平均盐度降低而上升。 - 相反，Prasinos绿藻、近盐骨条藻以及变形菌硫酸盐还原菌（Candidatus Thiobios zoothamnicoli）等均与水温呈负相关。特别地，尽管Fortii鳍藻作为优势种的季节最冷，CCA图也显示其与温度呈负向关系，但在统计上其丰度与四个环境因子的相关性均不显著（文中未提供显著性p值，但其分布明确指向冷季）。
本研究得出结论：东海沿岸的浮游植物群落多样性和优势类群存在显著的季节性演替，这主要受海水温度、长江径流以及台湾暖流等环境因素的综合调控。具体而言，多样性在秋季最高、夏季最低；绿藻门的微单胞藻属几乎全年占优，而在春季被Prasinos绿藻替代；硅藻（骨条藻）在夏秋季占据主导，而甲藻（Fortii鳍藻）则在冬春季取而代之。
本研究的科学价值体现在其方法论和生态发现两个层面。在方法论上，它验证了基于rbcL基因的分子方法在东海区域进行浮游植物群落结构研究的高效性，特别是补充了显微镜检难以鉴定的微微型浮游植物（如微单胞藻）的大量信息，并成功将ID型rbcL引物应用于部分甲藻（如Fortii鳍藻）的检测。在实际应用价值上，研究明确指出了产腹泻性贝毒（DSP）的Fortii鳍藻已成为冬春季节的最优势物种，且其丰度与低温的负相关关系提示春季是其最可能爆发有害藻华的季节。这一发现为该海域的贝类食品安全监测和有害藻华预警提供了关键的生物学依据。
本研究的主要亮点体现在三个方面：第一，重大生态发现: 定量揭示了优势类群从硅藻（夏秋中肋骨条藻/近盐骨条藻）到甲藻（冬春Fortii鳍藻）清晰的季节性接力模式，为东海近30年来浮游植物群落由硅藻主导向甲藻比例急剧增加的趋势提供了精细的分子证据。第二，方法学优势: 创新性地系统联用IAB型和ID型两对rbcL分子标记，一举捕获了涵盖蓝藻、绿藻、硅藻、甲藻、隐藻等多大门类的浮游生物，其覆盖面超越了传统镜检和18S rRNA基因方法。第三，关键物种的识别与环境关联: 首次在分子水平明确了潜在产毒藻Fortii鳍藻在该海域的冬季绝对优势地位，并将其丰度与低温环境紧密关联，为该生态灾害生物的监控指明了确切的时间窗口。