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欧洲稀有食用菌Hericium flagellum中新型神经生长促进剂的发现与表征
作者及发表信息
本研究由Winnie Chemutai Sum（德国亥姆霍兹感染研究中心微生物药物研究所/布伦瑞克工业大学）、Sherif S. Ebada（德国亥姆霍兹感染研究中心/埃及Ain Shams大学药学院）、Marco Kirchenwitz（德国亥姆霍兹感染研究中心细胞生物学系）等合作团队完成，通讯作者为Marc Stadler。研究成果于2023年7月13日发表于《Journal of Agricultural and Food Chemistry》（J. Agric. Food Chem. 2023, 71, 11094−11103）。
学术背景
研究领域与动机
本研究聚焦于天然产物化学与神经药理学交叉领域。随着全球老龄化加剧，阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病（Neurodegenerative Diseases, NDDS）的治疗需求迫切，而现有神经生长因子（Nerve Growth Factor, NGF）因分子量大、难以穿透血脑屏障且易被蛋白酶降解，临床应用受限。Hericium属真菌（如猴头菇Hericium erinaceus）的传统药用价值已被广泛研究，但其近缘物种Hericium flagellum（一种依赖银冷杉宿主生长的稀有红皮书物种）的次生代谢产物尚未充分探索。本研究旨在从H. flagellum的固体培养物中分离新型神经活性化合物，为开发低分子量NGF替代物提供先导分子。
科学问题与目标
团队前期通过HPLC-MS分析发现H. flagellum的稻米培养基中存在未知代谢峰，本研究旨在：(1) 分离纯化这些化合物；(2) 通过核磁共振（NMR）和高分辨质谱（HRESIMS）解析其结构；(3) 评估其促进PC-12细胞（大鼠嗜铬细胞瘤细胞）神经突生长的活性。
研究流程与方法
1. 菌株培养与代谢物提取
- 菌株来源：H. flagellum子实体于2015年从德国巴伐利亚森林国家公园的银冷杉原木上采集（保藏号DSM108284）。
- 培养体系：采用液态（YM培养基）和固态（稻米培养基）发酵，静态培养90天。
- 提取方法：
- 液态培养物经XAD-16N树脂吸附后丙酮萃取，乙酸乙酯分区；
- 固态培养物直接丙酮浸提，获得6.4 g粗提物。
2. 化合物分离与结构鉴定
- 色谱分离：采用制备型HPLC（C18柱，甲酸-乙腈梯度洗脱），从固态培养物中分离出Hericioic acids A-D（1-4），液态培养物中分离出Hericioic acids E-G（5-7）和Hericiofuranoic acid（8）。
- 结构解析技术：
- 核磁共振：700 MHz 1H NMR和175 MHz 13C NMR（氘代甲醇或DMSO为溶剂），结合1H-1H COSY、HMBC、HSQC和ROESY确定骨架与连接方式。
- ECD计算：通过TDDFT（B3LYP/6-31G*水平）计算Hericioic acid A的电子圆二色谱，确定其C-3′绝对构型为R型。
- 质谱：HRESIMS（Bruker Maxis ESI-TOF）精确测定分子量，推导分子式（如C14H17NO5 for 1）。
3. 生物活性评估
- 细胞模型：PC-12细胞（ECACC来源）在补充5 ng/mL NGF的培养基中培养。
- 实验设计：
- 测试化合物浓度1 mg/mL（DMSO溶解），48小时后通过IncuCyte S3活细胞成像系统量化神经突长度。
- 以DMSO为阴性对照，统计学分析采用GraphPad Prism v8（Student t检验）。
- 安全性测试：通过L929（小鼠成纤维细胞）和KB 3.1（人宫颈腺癌细胞）评估细胞毒性。
主要结果
1. 新化合物结构特征
- Hericioic acids A-G（1-7）：均为首次报道的异吲哚酮（Isoindolinone）或苯并呋喃酮（Benzofuranone）衍生物，侧链含羧酸基团（如化合物1的C3′位R构型）。
- Hericiofuranoic acid（8）：新型异呋喃-2,5-醌结构，紫外特征吸收峰348 nm。
2. 神经生长促进活性
- 显著活性化合物：3、4和8在5 ng/mL NGF存在下，神经突长度显著高于对照组（p<0.05），其中8的刺激效果最强。
- 构效关系：侧链长度与活性相关，如Hericioic acid A（短链）活性较弱，而含共轭双键的4和8活性更强。
- 安全性：所有化合物在1 mg/mL浓度下无显著细胞毒性。
3. 结构解析关键数据
- 化合物1：HMBC中H-2（δH 8.35）与C-1（δC 170.3）相关，证实异吲哚酮核心；ROESY显示H3-8与H-7空间接近，确定甲氧基位置。
- 化合物8：H-1（δH 8.14）与C-2（δC 182.8）的HMBC相关，确认醌式结构。
结论与价值
科学意义
- 首次从H. flagellum中发掘出8个结构新颖的神经活性化合物，拓展了Hericium属次生代谢物的化学多样性。
- 揭示了固态培养对产生异吲哚酮类化合物的优势（液态培养主要生成Cyathane二萜），为代谢调控提供新思路。
应用潜力
- Hericioic acids和Hericiofuranoic acid可作为NGF模拟物的先导分子，其低分子量特性有望克服现有神经生长因子的递送瓶颈。
- 为神经退行性疾病的天然药物开发提供候选结构，尤其化合物8的异呋喃醌骨架具有进一步结构优化的潜力。
研究亮点
1. 新颖性：首次报道H. flagellum的异吲哚酮类代谢物，其中Hericiofuranoic acid为全新骨架。
2. 方法学：结合NMR、ECD计算与活性筛选的多维策略，为天然产物研究提供范式。
3. 生态价值：关注稀有物种的药用潜力，强调生物多样性在药物发现中的重要性。
补充发现
- 研究指出Hericium属中异吲哚酮类化合物目前仅见于子实体和固态培养物，提示次生代谢途径受培养条件显著影响。这一发现对真菌代谢工程具有指导意义。
此研究通过系统化的天然产物化学与药理学分析，为神经保护剂开发提供了重要科学依据，同时凸显了未被充分开发的真菌资源在生物医药领域的价值。