锂通过上调内皮细胞Wnt/β-catenin信号通路减轻小鼠脑缺血再灌注后血脑屏障破坏的机制研究

一、研究团队与发表信息
本研究由Ya-Bin Ji、Qiang Gao、Xi-Xi Tan等共同完成，通讯作者为Junlei Chang（中国科学院深圳先进技术研究院生物医学与生物技术研究所）。合作单位包括南方医科大学南方医院神经内科、郑州大学第一附属医院神经外科等。成果发表于Neuropharmacology期刊（2021年1月29日在线发表，卷186，文章编号108474）。

二、学术背景
研究领域：缺血性脑卒中（ischemic stroke）的血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）保护策略。
研究动机：尽管再灌注治疗（如rtPA静脉溶栓）是急性缺血性脑卒中的主要手段，但其狭窄的治疗时间窗（4.5-6小时）和再灌注后BBB破坏导致的脑水肿、出血等并发症严重限制疗效。既往研究表明，Wnt/β-catenin信号通路对BBB形成和稳态维持至关重要，但尚无基于此机制的临床可用药物。锂（lithium）作为双相情感障碍治疗药物，已知可抑制GSK-3β从而激活Wnt/β-catenin信号，但其是否通过内皮细胞特异性通路保护BBB尚不明确。
研究目标：明确锂是否通过上调内皮细胞Wnt/β-catenin信号减轻缺血再灌注（I/R）后的BBB破坏，并解析其分子机制。

三、研究流程与方法
1. 动物模型与锂处理
- 研究对象：103只8-10周龄C57BL/6雄性小鼠，随机分为假手术组、I/R模型组（1小时大脑中动脉阻塞MCAO+48小时再灌注）及锂治疗组（3 mmol/kg腹腔注射，再灌注即刻及24小时后各一次）。
- 基因敲除模型：构建内皮特异性Gpr124敲除小鼠（Gpr124flox/flox; Cdh5-CreERT2），通过他莫昔芬诱导敲除，验证其对Wnt/β-catenin信号的影响。

1. 功能评估

   • 神经功能评分：采用神经缺陷评分（neurologic deficit score）、抓握试验（grab test）和水平梯测试（horizontal ladder test）。
     
   • 梗死体积测定：TTC染色量化梗死区域，校正脑水肿影响。
     
   • BBB完整性检测：
     
     • Evans Blue渗透实验：定量脑组织染料泄漏（荧光法）。
       
     • IgG外渗分析：免疫荧光染色检测血管外IgG沉积。
       

2. 分子机制解析

   • 蛋白表达分析：Western blot检测紧密连接蛋白（claudin-5、ZO-1）、MMP-9及β-catenin活性形式。
     
   • 信号通路激活：免疫荧光共定位CD31（内皮标记）与活性β-catenin，RT-qPCR检测Wnt靶基因（Axin2、Apcdd1）。
     
   • 体外实验：
     
     • 氧糖剥夺/恢复（OGD/R）模型：小鼠脑微血管内皮细胞（bEnd.3）在OGD/R条件下评估锂对TEER（跨内皮电阻）和FITC-葡聚糖通透性的影响。
       
     • TopFlash报告基因实验：量化Wnt/β-catenin信号活性。
       

3. 数据统计

   • 采用SPSS 20.0进行单因素ANOVA（多组比较）或t检验（两组比较），数据以均值±标准误表示，显著性阈值p<0.05。

四、主要结果
1. 锂改善脑卒中预后
- 3 mmol/kg锂治疗使梗死体积减少至34.1±1.8%（对照组58.3±2.8%，p<0.0001），并显著改善神经功能评分（p<0.05）。
- TUNEL/NeuN共染色显示锂减少神经元凋亡（p=0.0099）。

1. BBB保护作用

   • Evans Blue泄漏减少45.7%（p=0.0064），IgG外渗降低65.8%（p<0.0001）。
     
   • Western blot显示锂逆转I/R诱导的claudin-5和ZO-1下降（p<0.05），并抑制MMP-9表达（p=0.0001）。
     

2. Wnt/β-catenin信号依赖机制

   • 免疫荧光显示锂增加梗死区内皮细胞活性β-catenin（p=0.0011），RT-qPCR证实Apcdd1表达上调（p=0.0233）。
     
   • Gpr124敲除验证：在Gpr124-KO小鼠中，锂的BBB保护作用完全消失（梗死体积和IgG外渗无改善，p>0.05），证实其对Gpr124介导的内皮Wnt信号的特异性依赖。
     

3. 非经典Wnt信号调控

   • 锂增加磷酸化JNK（Wnt/PCP通路标志物，p=0.0085），但对Wnt/Ca2+通路（phospho-CaMKII）无显著影响，提示其可能协同调控多通路。
     

五、结论与价值
1. 科学意义：首次阐明锂通过Gpr124依赖性内皮Wnt/β-catenin信号通路保护BBB，为缺血性脑卒中再灌注后并发症提供了特异性靶点。
2. 应用价值：锂作为临床已获批药物，可快速转化用于延长溶栓时间窗或联合rtPA治疗，降低出血风险。
3. 拓展方向：该机制可能适用于转移性脑瘤、白血病等BBB破坏相关疾病。

六、研究亮点
1. 机制创新：揭示锂的BBB保护作用依赖于内皮特异性Wnt信号，而非既往认知的神经元保护。
2. 方法学贡献：结合内皮条件性敲除小鼠（Gpr124-KO）与OGD/R细胞模型，多维度验证信号通路依赖性。
3. 转化潜力：提出老药新用策略，规避Wnt激动剂的潜在致癌风险（短期使用安全性已获临床验证）。

七、其他发现
锂对Wnt/PCP通路的调控作用提示其可能通过平衡经典与非经典Wnt信号维持BBB稳态，为后续多通路协同治疗提供新思路。