本研究由K. Kimura、M. Yamaoka和Y. Kamisaka三位作者共同完成，他们均来自日本产业技术综合研究所（AIST）生物资源与功能研究所。研究论文发表于2004年的《Journal of Microbiological Methods》第56卷，标题为《Rapid estimation of lipids in oleaginous fungi and yeasts using Nile red fluorescence》。

学术背景

研究领域为微生物脂质代谢与快速检测技术。产油微生物（如某些真菌和酵母）能积累超过细胞干重50%的脂质，这些脂质可作为食品或能源原料（如生物柴油）。传统脂质检测方法（如气相色谱法）需繁琐的提取、纯化步骤，耗时且难以高通量应用。此前虽有基于荧光染料（如尼罗红，Nile red）的脂质检测方法，但仅适用于分散细胞，且未针对不同微生物或培养条件优化。本研究旨在开发一种普适、快速的尼罗红荧光法，用于多种产油微生物（包括易形成菌丝团的真菌）的脂质定量。

研究流程

1. 微生物培养与样品制备

   • 研究对象：包括3种产油酵母（*Lipomyces starkeyi*、*Rhodosporidium toruloides*、*Cryptococcus curvatus*）和3种丝状真菌（*Mortierella*属的3个种），均来自日本发酵研究所（IFO）。
     
   • 培养条件：采用优化培养基（含30 g/L葡萄糖），27°C摇床培养。丝状真菌因易形成菌团，需额外用玻璃珠振荡5-10分钟分散菌丝。
     

2. 尼罗红染色优化

   • 染色参数：测试不同尼罗红浓度（0.24–4.5 μg/mL）、染色时间（1–20分钟）及激发波长（488 nm vs. 552 nm）。
     
   • 光谱校正：通过扣除细胞自身荧光背景，获取净荧光光谱（400–700 nm）。脂质信号以校正后光谱峰值强度（565–585 nm）表示。
     

3. 脂质定量验证

   • 传统方法对照：通过气相色谱分析细胞脂肪酸甲酯（FAME）定量总脂质。
     
   • 荧光法校准：比较荧光强度与气相色谱数据，建立线性关系。
     

4. 方法适用性验证

   • 不同微生物测试：评估方法对酵母（单细胞）和真菌（菌丝团）的适用性。
     
   • 灵敏度范围：检测限低至2 μg脂质/mL培养液，最高可达5000 μg/mL。
     

主要结果

1. 染色条件优化

   • 最佳尼罗红浓度为0.24–0.47 μg/mL，染色5分钟。488 nm激发比552 nm信噪比更高（图1）。
     
   • 荧光强度与脂质含量在0–2.5 mg/mL范围内呈线性（R² > 0.86），仅*R. toruloides*因脂质组成差异斜率偏低（图5）。
     

2. 微生物形态影响

   • 酵母（如*L. starkeyi*）脂体大而少（直径达10 μm），真菌（如*Mortierella*）脂体小而多（图4）。方法均适用，但真菌需玻璃珠预处理。
     

3. 与传统方法一致性

   • 荧光强度与气相色谱数据高度相关（如*M. ramanniana*的R²=0.983），证明方法可靠性（图5）。
     

结论与价值

1. 科学价值：首次系统优化尼罗红荧光法，解决了传统方法耗时、无法高通量的痛点，为脂质代谢研究提供高效工具。
   
2. 应用价值：适用于工业化菌种筛选（如高产脂突变体）和培养过程监控，尤其适合丝状真菌等复杂样本。
   

研究亮点

• 普适性：覆盖单细胞酵母至菌丝团真菌，突破此前方法局限。
  
• 灵敏度：检测范围跨三个数量级（2–5000 μg/mL），无需浓缩或稀释。
  
• 创新点：通过光谱校正和峰值定量，消除细胞自发荧光干扰，提升准确性。
  

其他发现

• 尼罗红荧光特性受脂质极性影响（中性脂信号强于极性脂），但优化后仍能统一量化。
  
• 长时间染色（>5分钟）或高染料浓度（>2.3 μg/mL）会导致荧光淬灭，需严格控制条件。
  

（注：全文术语首次出现时保留英文，如Nile red=尼罗红，FAME=脂肪酸甲酯。）