本研究由 Fabian Elgner、Catarina Sabino、Michael Basic、Daniela Ploen、Arnold Grünweller 和 Eberhard Hildt 共同完成。其中，Fabian Elgner、Catarina Sabino、Michael Basic、Daniela Ploen 和通讯作者 Eberhard Hildt 来自德国保罗-埃利希研究所（Paul-Ehrlich-Institut）病毒学系；Arnold Grünweller 来自德国马尔堡菲利普斯大学（Philipps-Universität Marburg）药物化学系；Eberhard Hildt 同时隶属于德国感染研究中心（German Center for Infection Research, DZIF）。该研究于2018年1月31日投稿，2018年3月24日被接收，并于2018年3月27日发表在开放获取期刊 Viruses 上，文章编号为 2018, 10, 149。
寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）是一种由蚊媒传播的新兴病毒，属于黄病毒科黄病毒属，与登革病毒、西尼罗病毒和黄热病毒等具有较近的亲缘关系。寨卡病毒基因组为约11 kb的单股正链RNA，其5′端和3′端均存在高度结构化的非翻译区（untranslated regions, UTRs），这些区域可以形成发夹结构，对病毒的复制和翻译至关重要。寨卡病毒基因组可直接作为信使RNA（mRNA），翻译产生一个约3419或3410个氨基酸的多聚蛋白，随后由病毒和宿主蛋白酶进一步加工为三个结构蛋白和七个非结构蛋白。
2016年在南美洲暴发的寨卡疫情与格林-巴利综合征以及孕妇感染后新生儿小头畸形等严重神经系统病变密切相关，世界卫生组织因此将寨卡病毒感染列为“国际关注的突发公共卫生事件”。这一情况凸显了对新兴病毒病原体快速反应的广谱抗病毒药物的迫切需求。由于RNA病毒突变率较高，直接靶向病毒蛋白的药物容易诱导耐药毒株的产生，因此靶向病毒生命周期所必需的宿主蛋白成为一种有前景的策略。
Silvestrol 是从植物 Aglaia foveolata 中分离得到的天然化合物，属于 rocaglate 家族。它被鉴定为 DEAD-box RNA 解旋酶真核起始因子4A（eukaryotic initiation factor-4A, eIF4A）的特异性抑制剂。eIF4A 是真核翻译起始复合物 eIF4F 的组成部分，该复合物还包含帽结合蛋白 eIF4E 和支架蛋白 eIF4G。eIF4A 的解旋酶活性可以解开 mRNA 5′UTR 中的二级结构，从而为 43S 前起始复合物创造结合平台。Silvestrol 通过选择性结合 eIF4A，使其从 eIF4F 复合物中耗竭，从而抑制翻译。此前研究表明，silvestrol 对埃博拉病毒（负链RNA病毒）以及冠状病毒和小核糖核酸病毒（正链RNA病毒）均具有强效抗病毒活性。鉴于寨卡病毒基因组同样具有5′帽结构且其5′UTR具有明显的二级结构，本研究旨在探究 silvestrol 对两株寨卡病毒翻译和复制的影响。
本研究以 A549 细胞（人肺癌细胞系）和原代人肝细胞（primary human hepatocytes, PHHs）为研究模型，使用两株寨卡病毒：来自乌干达的祖先株 976 Uganda（ZIKV-U）和来自法属波利尼西亚的 PF13/251013-18 株（ZIKV-FP），后者是首次与小头畸形相关的毒株。病毒感染复数（multiplicity of infection, MOI）为0.1，在部分验证实验中提高到 MOI=1。Silvestrol 以5 nM、10 nM、50 nM（在 A549 细胞中）以及5 nM、10 nM、100 nM（在原代人肝细胞中）的浓度进行干预，二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂对照。
研究首先通过 PrestoBlue 细胞活力实验和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放实验评估 silvestrol 在 A549 细胞中的细胞抑制（cytostatic）与细胞毒性（cytotoxic）效应。PrestoBlue 实验检测细胞代谢活性，LDH 释放实验则反映细胞死亡情况。原代人肝细胞的毒性通过丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）活性测定、明场成像和 PrestoBlue 实验进行检测。
在抗病毒效果评估方面，研究者采用了多种互补的实验方法。免疫荧光显微镜技术使用 NS1 特异性抗体检测病毒感染阳性细胞的数量，并以 DAPI 染色观察细胞核。细胞内和细胞外寨卡病毒 RNA 通过实时定量 PCR（RT-qPCR）进行定量，细胞内 RNA 以 RPL27 转录本为内参进行标准化。细胞培养上清中释放的感染性病毒颗粒通过空斑实验（plaque assay）在 Vero 细胞上测定病毒滴度。Western blot 分析用于检测细胞裂解物中 NS1 蛋白的表达水平，以 β-actin 作为上样对照。此外，还检测了已知依赖 eIF4A 翻译的癌基因 PIM1 的表达，以及主要穹窿蛋白（major vault protein, MVP）的表达变化。为验证 silvestrol 对 eIF4A 依赖翻译的特异性，研究还使用依赖内部核糖体进入位点（internal ribosomal entry site, IRES）翻译的丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）作为对照，在 Huh7.5 细胞中检测 silvestrol 对 HCV 蛋白 NS3 和 NS5A 表达的影响。数据处理和统计分析使用 GraphPad Prism 6.07 软件，显著性检验为非配对双尾 Student t 检验。
PrestoBlue 实验显示，silvestrol 从5 nM 浓度开始即可时间依赖性和浓度依赖性地抑制 A549 细胞的代谢活性。LDH 释放实验在24 h内未检测到细胞毒性，48 h时仅50 nM 浓度出现 LDH 活性增加，72 h时各浓度均出现一定的细胞毒性，但 DAPI 染色显示仍有大量完整细胞核。这些结果表明 silvestrol 在低浓度下主要表现为细胞抑制效应而非细胞毒性。
免疫荧光显微镜分析显示，在 ZIKV-FP 感染的 A549 细胞中，silvestrol 处理后 NS1 阳性细胞数量和荧光强度在48 h和72 h显著下降。而 ZIKV-U 株在相同条件下未见显著效果（除5 nM 处理48 h外）。这表明 silvestrol 对寨卡病毒感染在 A549 细胞中的扩散具有抑制作用，且不同毒株间的敏感性可能存在差异。
RT-qPCR 结果表明，对于两株寨卡病毒，5 nM 和50 nM silvestrol 在24 h、48 h和72 h三个时间点均导致细胞内和细胞外寨卡病毒基因组数量显著减少。然而，10 nM 浓度处理时，病毒的 RNA 水平在细胞内仅有较弱降低，在细胞外病毒 RNA 水平上几乎无效果。空斑实验的结果与 RT-qPCR 基本一致：ZIKV-FP 感染细胞经5 nM和50 nM silvestrol 处理24 h和48 h后，释放的感染性病毒颗粒数量减少；72 h时5 nM 处理仍有效，但50 nM 处理无显著效果。ZIKV-U 株在24 h和48 h也观察到病毒滴度下降，但72 h时未见减少。研究者认为，这种缺乏严格剂量-效应关系的现象可能反映了 silvestrol 对寨卡病毒生命周期的直接抑制与其对宿主细胞抗病毒防御机制翻译的干扰之间的复杂平衡。由于 silvestrol 抑制 eIF4A，它一方面抑制病毒 RNA 的翻译，另一方面也抑制多种宿主因子的翻译，包括核糖核酸酶、蛋白酶体蛋白、溶酶体蛋白或自噬相关蛋白。如果这些参与病毒基因组或蛋白降解的活性受到抑制，可能导致病毒基因组稳定性增加，从而部分补偿 silvestrol 对病毒生命周期的其他抑制作用。
Western blot 分析显示，5 nM silvestrol 处理48 h和72 h后，两株寨卡病毒感染的细胞中 NS1 蛋白水平均显著降低；50 nM silvestrol 在三个时间点均强烈减少 NS1 蛋白量。10 nM 处理时 NS1 蛋白几乎无减少，与前述结果一致。同时，PIM1 蛋白表达也呈浓度依赖性下降，证实了 silvestrol 对 eIF4A 依赖翻译的抑制。在 MOI=1 的高感染复数条件下，silvestrol 仍能降低寨卡病毒 RNA 和蛋白水平，进一步支持该药物通过 eIF4A 依赖机制发挥作用。对 HCV 的实验显示，silvestrol 处理不降低 HCV 的 NS3 和 NS5A 蛋白水平，这证实了 silvestrol 对 eIF4A 依赖的帽依赖性病毒翻译的特异性，而不影响 IRES 依赖性翻译。
在来自两位供体的原代人肝细胞中，ZIKV-FP 感染后经 silvestrol 处理，24 h时各浓度均未见显著的病毒基因组减少，但48 h和72 h时细胞外病毒基因组显著减少。空斑实验确认感染性病毒颗粒数量在所有浓度和时间点均大幅下降，部分样品甚至低于检测限。同样地，10 nM 处理组的抑制效果弱于5 nM 和100 nM 组，再次表现出非严格剂量-效应关系。ALT 活性检测显示大多数样品低于检测限，仅100 nM 处理时略有升高（约7 U/L），远低于肝损伤阈值（男性>41 U/L）。PrestoBlue 实验和明场成像也证实100 nM silvestrol 在48 h和72 h对部分供体的原代肝细胞有毒性作用，但较低浓度无毒性且显著降低病毒载量。这一结果排除了抗肿瘤效应的影响，证明 silvestrol 的抗寨卡病毒作用在原代非转化细胞中同样成立。
本研究证明 silvestrol 对寨卡病毒的复制具有显著的抑制作用。这一抗病毒作用依赖于 silvestrol 对 eIF4A 的特异性抑制，从而阻断寨卡病毒基因组5′帽依赖性翻译。研究通过 PIM1 蛋白水平下降和 HCV IRES 依赖性翻译不受影响两个对照实验，明确了 eIF4A 在寨卡病毒翻译中的关键作用及 silvestrol 的作用特异性。由于 silvestrol 靶向宿主蛋白 eIF4A 而非病毒蛋白，基于此机制的抗病毒策略可避免因病毒高突变率而产生的耐药性问题。研究中使用原代人肝细胞验证了 silvestrol 的抗病毒活性，排除了肿瘤细胞系中细胞抑制效应的干扰。这些发现为鉴定参与寨卡病毒感染控制的宿主因子提供了重要线索，也为开发针对多种病毒感染的广谱抗病毒策略奠定了实验基础。
本研究的亮点在于：第一，首次系统性地证明了 eIF4A 抑制剂 silvestrol 对寨卡病毒复制的抑制作用，并揭示寨卡病毒翻译对 eIF4A 的依赖性；第二，使用两种不同致病背景的寨卡病毒株进行比较研究，发现乌干达祖先株对 silvestrol 的敏感性低于法属波利尼西亚株，这为进一步探究5′UTR 二级结构在抗病毒敏感性中的作用提供了线索；第三，研究使用了肿瘤细胞系和原代细胞双重模型，排除了 silvestrol 抗肿瘤活性对抗病毒效果评估的干扰，提高了结论的可靠性；第四，发现 silvestrol 的抗病毒效应存在非典型剂量-效应关系，并提出这可能与 silvestrol 同时抑制宿主抗病毒因子（如 MVP）翻译的复杂调控机制有关；第五，通过 HCV 对照实验确证了 silvestrol 对 eIF4A 依赖的帽依赖性翻译的特异性。
本研究在讨论部分提出了一个重要的机制假说：silvestrol 可能通过下调主要穹窿蛋白 MVP 的表达和改变其胞质定位来削弱宿主抗病毒天然免疫信号。MVP 被认为通过影响 IRF7 和 I 型干扰素信号通路发挥抗病毒作用。silvestrol 处理后 MVP 蛋白水平下降并从胞质向核周区域转位，这可能解释了在10 nM 浓度下观察到的寨卡病毒部分恢复现象。这一发现提示 eIF4A 抑制剂在抗病毒应用中可能存在“双刃剑”效应，即同时抑制病毒翻译和宿主抗病毒蛋白翻译。因此，虽然 silvestrol 的直接临床应用可能面临复杂性，但本研究确认了 eIF4A 作为可靶向的宿主因子，为开发抗寨卡病毒及其他具有结构化5′UTR 的病毒的广谱抗病毒策略提供了重要的概念验证。未来的研究需要进一步表征 silvestrol 敏感的5′UTR 结构特征，以及 MVP 对寨卡病毒生命周期的影响机制。