结核分枝杆菌耐热抗原（MTB-HAg）组分分析及其对γδ T细胞功能的调控研究

作者及发表信息
本研究由Jing Wei、Fangzheng Guo、Yamin Song等来自Bengbu Medical University（中国蚌埠医学院）和Xinjiang Key Laboratory of Hotan Characteristic Chinese Traditional Medicine Research（新疆和田特色中药研究重点实验室）的研究团队共同完成，通讯作者为Hongtao Wang和Tao Xu。研究成果发表于期刊*Cellular & Molecular Biology Letters*（2024年，卷29，第70期）。

学术背景
结核病（Tuberculosis, TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）引起的致命传染病，2021年全球死亡人数达160万。耐药结核（MDR-TB/XDR-TB）和HIV合并感染加剧了防控难度。γδ T细胞作为先天免疫与适应性免疫的“桥梁”，在抗MTB感染中发挥关键作用，但其激活机制尚不明确。MTB耐热抗原（MTB-HAg）是MTB减毒株H37Ra经121℃高温处理后释放的肽抗原，可特异性诱导γδ T细胞增殖，但其具体组分及功能蛋白未知。本研究旨在解析MTB-HAg的蛋白质组成，筛选能激活γδ T细胞的功能蛋白，为结核疫苗和诊断试剂的开发提供理论依据。

研究流程与方法
1. MTB-HAg制备与组分分析
- 制备流程：H37Ra菌株经7H11培养基培养后，用Sauton’s液体培养基扩增至对数生长期，离心收集菌体，121℃加热20分钟，过滤获取上清液（MTB-HAg）。
- 质谱分析：通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）鉴定出564种蛋白质，包括热休克蛋白（HSPs，如GroEL1、GroEL2、HspX）和MTB特异性抗原（如HBHA、MPT63）。

1. 重组蛋白表达与纯化

   • 基因克隆：从H37Ra基因组中扩增12个目标基因（如*htpg*、*dnak*、*hspx*），插入pET-28a载体，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。
     
   • 蛋白纯化：采用镍柱亲和层析（Ni-NTA）纯化重组蛋白，SDS-PAGE和Western blot验证纯度与特异性。最终成功表达10种蛋白（如HspX、GroEL1、GroES），ESXJ和ESXA未成功表达。
     

2. γδ T细胞功能实验

   • 细胞刺激：用重组蛋白（5 μg/mL）刺激健康人外周血单个核细胞（PBMCs，n=8），以IL-2（50 U/mL）为对照，培养9-12天后检测γδ T细胞增殖（流式细胞术）。
     
   • 细胞因子检测：通过细胞内染色分析TNF-α和IFN-γ的产生，发现HspX、GroEL1、GroES显著促进γδ T细胞（尤其是Vγ2Vδ2亚群）增殖及细胞因子分泌（TNF-α: 5.75±1.12%；IFN-γ: 5.64±0.98%），而其他蛋白（如DnaK、HBHA）无此效应。
     
   • 抗菌功能验证：将激活的γδ T细胞与MTB感染的THP-1细胞共培养，通过菌落计数（CFU）证实其可抑制细胞内MTB生长（p<0.01）。
     

主要结果
1. MTB-HAg组分特征：LC-MS鉴定出564种蛋白，其中热休克蛋白（如HspX、GroEL1）和MTB特异性抗原（如MPT63）占比最高。
2. γδ T细胞特异性激活：HspX、GroEL1、GroES能特异性诱导Vγ2Vδ2 T细胞扩增（占γδ T细胞的86-89%），并促进TNF-α和IFN-γ分泌，而αβ T细胞无响应。
3. 抗菌效应：激活的γδ T细胞通过分泌TNF-α和IFN-γ抑制THP-1细胞内MTB的生长，CFU显著降低。

结论与意义
本研究首次系统解析了MTB-HAg的蛋白质组成，明确HspX、GroEL1和GroES是激活γδ T细胞的关键功能蛋白。这些蛋白通过诱导Vγ2Vδ2 T细胞增殖及抗菌细胞因子分泌，增强宿主对MTB的免疫防御。科学价值在于揭示了γδ T细胞抗MTB的分子机制，应用价值为结核疫苗设计（如基于HspX/GroEL1的亚单位疫苗）和快速诊断试剂开发提供了新靶点。

研究亮点
1. 方法创新：结合LC-MS高通量筛选与重组蛋白功能验证，首次建立MTB-HAg组分与γδ T细胞激活的关联性分析流程。
2. 发现特异性抗原：HspX、GroEL1和GroES的γδ T细胞激活功能为首次报道，填补了MTB免疫逃逸机制的研究空白。
3. 转化潜力：筛选的蛋白可作为结核疫苗候选抗原或诊断标志物，尤其针对耐药结核的免疫治疗。

局限性：研究仅基于体外实验，未验证动物模型或结核患者的临床样本；重组蛋白可能缺乏天然构象的免疫原性。未来需进一步探索其在体内的保护效力及与现有疫苗（如BCG）的协同作用。