萜类天然产物创新发现策略：综述与展望

本文是一篇发表于《Current Opinion in Microbiology》期刊2025年第83卷的综述文章，由武汉大学、上海交通大学等机构的Shu Cheng、Xinghuan Wang、Zixin Deng和Tiangang Liu（通讯作者）共同撰写。文章聚焦于微生物学、合成生物学与天然产物化学交叉领域，系统总结了当前在高效发现新颖萜类天然产物方面所面临的挑战以及最新的技术策略，并对未来发展趋势进行了展望。萜类化合物作为自然界中广泛存在且结构多样的一类天然产物，在医药、农业、香料等领域具有重要应用价值，但传统发现方法存在重复率高、产量低、通量有限等瓶颈。本综述旨在梳理并评述近年来涌现的创新性方法，为加速高价值萜类化合物的发现与应用提供路线图。

一、 萜类高效发现面临的挑战与策略框架

文章开篇即指出，尽管萜类化合物（如紫杉醇、青蒿素）已成功开发为药物，但半个多世纪以来，全新的天然产物药物及其先导化合物的发现依然有限，远不能满足关键的医疗需求。传统上，萜类化合物的发现主要依赖于三种策略：1）直接从生物样本中分离；2）通过同源重组等手段激活宿主内的萜类基因（簇）；3）异源表达。这些方法虽已发现大量结构多样的萜类，但也暴露出明显问题：新化合物发现中重复率高；已发现的产物往往产量极低，难以进行全面的生物活性评价；单个研究团队可获取的化合物库有限，制约了多功能、多靶点的活性筛选。因此，技术创新势在必行。

为解决上述瓶颈，文章系统性地归纳并阐述了三大前沿策略，构成了当前萜类高效发现的创新框架：1）构建高产萜类底盘细胞，实现前体高效供给与新骨架挖掘；2）利用自动化工作站实现高通量、批量化萜类基因簇挖掘与表征；3）借助人工智能（AI）辅助酶功能预测与设计，发现新机制与新结构。这些策略的整合应用，有望在萜类探索中取得实质性进展。

二、 高产萜类底盘细胞：高效挖掘的基石

微生物高产萜类底盘细胞，是一类经过优化、能够高效过量生产萜类前体的工程菌株或细胞工厂。它们不仅可用于目标产物的高产，更能作为“活体反应器”来高效挖掘新型萜类化合物。其核心在于通过代谢工程手段，大幅增强萜类前体（如异戊烯基焦磷酸IPP、二甲基烯丙基焦磷酸DMAPP）的供应能力。

• 基于“靶向合成代谢”策略的底盘构建：文章介绍了以体外蛋白滴定反应为指导的“靶向合成代谢”策略。通过体外精确测定萜类生物合成途径中各酶的最佳比例，以此指导在微生物宿主（如大肠杆菌）体内对整条途径进行工程化改造，从而快速实现高价值萜类稳定、高效的合成。例如，利用该策略构建的大肠杆菌底盘，通过简单更换萜类合酶（Terpene Synthases, TSs），成功从两种真菌来源的TSs（FgMS和FgGS）的异源表达菌株中检测到35种萜类化合物，包括2种新骨架的二萜，充分释放了TSs的生物合成潜力。
• 酿酒酵母底盘的应用优势与成果：酿酒酵母因其生物安全性、完整的细胞器与内膜系统以及易于工业化生产等优点，成为高效的萜类合成宿主。文章列举了多项成功案例：在过表达关键基因的酿酒酵母高效萜类合成平台上，真菌TS FgFS产生了10种倍半萜，并鉴定出1种5-7双环和2种5-6-3三环（互为异构体）的新骨架萜类。通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术系统性增强甲羟戊酸（MVA）途径代谢流，获得了能高产guaia-6,10(14)-diene的菌株，并以此为基础，通过七步化学催化成功半合成了具有抗肾癌活性的化合物Englerin A，为活性与临床研究提供了足量化合物。此外，在酵母平台上筛选具有甲基转移酶和TS双功能域的酶，通过定向突变和组合生物合成策略，产生了超过75种不同的非经典16碳萜类，验证了此类非经典TSs的普遍性。
• 丝状真菌宿主（如米曲霉）的独特价值：米曲霉作为异源表达宿主，能准确识别并剪切丝状真菌天然产物生物合成基因簇（Biosynthetic Gene Cluster, BGC）中的内含子，有效解决密码子偏好性问题。其内源的后修饰系统还能对外源基因产生的萜类骨架进行修饰，从而多样化产物输出。这为挖掘真菌来源的复杂修饰萜类提供了理想平台。

三、 自动化工作站：实现高通量萜类挖掘

传统单基因或基因簇挖掘方法难以解决萜类探索通量低的瓶颈。自动化高通量平台的广泛应用，使得高通量萜类发现成为可能。

• 酵母平台的高通量筛选：文章提到，利用异源表达合成生物学平台，通过高通量方法将41个真菌来源的萜类及聚酮类基因簇在酿酒酵母中表达，其中22个产生了可检测的化合物，最终鉴定了14个产物的结构。将自动化平台与酿酒酵母高产底盘结合，对34个新筛选的嵌合型萜类合酶（PTTSs）进行了批量功能表征，鉴定了24种二萜和倍半萜，其中包括2种新骨架倍半萜。
• 米曲霉平台的高通量组合生物合成：文章重点介绍了一项代表性工作。研究者采用组合生物合成与“自下而上”策略，根据萜类生物合成逻辑，将萜类BGC基因分为三个模块（TSs、P450s和其他后修饰基因），设计了三类带有不同营养缺陷型标记的表达载体。将来自5个实验室测序真菌菌株的39个萜类BGC重构为173个质粒并转化米曲霉，获得了208个突变株，从中检测到185种萜类化合物，包括103种倍半萜、59种二萜和23种倍半萜，其中包含62种萜类骨架和123种后修饰产物。该研究还从库中筛选出具有显著白细胞介素6抑制活性的倍半萜Mangicol J，并通过系统代谢工程将其产量提高了111倍。这项工作不仅构建了强大的化合物库以支持多样活性筛选，更建立了一套适用于丝状真菌的高价值萜类高效挖掘研究策略。

四、 人工智能：辅助新颖萜类的创新发现

为了降低重复发现率并揭示新机制，人工智能技术在萜类挖掘中发挥着越来越重要的作用。

• 基于序列与结构分析的理性设计：通过筛选与已知功能序列相似性低的TSs，可以在一定程度上避免相同萜类（骨架）的重复发现。例如，研究者利用HMMER和Pfam工具从巨型病毒中筛选出独特的TS OILTS，系统发育分析显示其与细胞生物中的I型TSs显著不同，能够合成大环倍半萜(+)-germacrene D-4-ol和线性单萜香叶醇。此外，基于已知TS晶体结构进行同源建模，分析活性口袋附近的非保守氨基酸位点，通过理性蛋白质改造（如点突变），可以扩大萜类结构的多样性。例如，对FGMS进行F65L和F153G突变，使其能够合成6种新骨架倍半萜，包括一种新颖的5-8-6-6四环倍半萜。
• AI驱动的新机制发现里程碑：文章着重介绍了一项突破性研究。在利用酿酒酵母高产底盘进行批量萜类挖掘过程中，首次筛选到具有新颖三萜合成机制的I型PTTSs——TVTS和MPMS。研究证实它们能够合成与传统角鲨烯途径不同的大环三萜Talaropentaene和Macroprohomene。同位素标记、体外蛋白反应和蛋白晶体结构分析表明，这些三萜的合成始于IPP和DMAPP聚合，并移除六异戊烯基焦磷酸（HexPP）的焦磷酸基团，通过一种新颖的环化机制生成新三萜骨架。研究者进一步利用AlphaFold2批量预测TSs的三维结构，通过底物分子对接，识别出另一个具有合成新型三萜潜力的TS CGCS，并最终鉴定了非角鲨烯来源的三萜Colleterpenol。这一发现挑战了“三萜骨架只能以角鲨烯为起始单元合成”的传统认知，揭示了I型PTTSs催化HexPP环化产生三萜骨架的普遍性，是萜类生物合成领域的重大概念突破。

五、 结论、未来展望与策略总结

文章总结指出，基因组时代和测序技术的飞速发展，正在推动高价值萜类发现发生变革性转变。新兴技术为高效萜类发现提供了硬件和软件支持。萜类基因（簇）的异源表达有效解决了挖掘宿主中“沉默”萜类的难题。基于“就近原则”，利用近源宿主开发的各种能够供应萜类前体的微生物底盘，克服了萜类生产相关基因表达适应性和产量低的问题。开发适用于不同微生物宿主的高通量自动化平台，促进了萜类基因（簇）的高效批量挖掘。结合新基因功能预测与特定蛋白质设计技术，甚至反向设计能够合成特定萜类核心骨架和功能基团的蛋白质，使得对TSs、细胞色素P450酶、甲基转移酶、糖基转移酶等后修饰酶的任意定向改造成为可能，这为设计和实现新型萜类及其衍生物的高效合成铺平了道路。最后，随机组合不同TSs和后修饰基因的异源表达，能以数量级的方式极大地扩展结构丰富的萜类化合物库。

文章末尾的表格（表1）清晰总结了已发展的萜类发现策略及其解决的瓶颈问题，包括：微生物样本直接分离（解决高积累度萜类发现，但耗时耗力）、原始宿主中萜类基因（簇）激活（解决基因沉默萜类发现，但技术难度高、耗时）、萜类基因（簇）异源表达（解决基因沉默萜类发现，但产量低）、基于高产萜类底盘的挖掘（解决高产萜类积累）、基于自动化工作站的挖掘（实现靶向活性萜类的高通量快速发现）、基于人工智能的发现（降低发现重复率，揭示新生物合成机制）以及随机组合TSs和后修饰基因（数量级扩展萜类衍生物）。

六、 综述的意义与价值

本综述的价值在于，它并非简单罗列文献，而是系统性地构建了一个多技术融合驱动的萜类创新发现范式。文章清晰地指出了当前领域的关键瓶颈，并围绕“底盘构建”、“自动化”和“人工智能”这三个核心支柱，通过大量最新、具有代表性的研究成果（包括多篇标注为“特殊兴趣”和“突出兴趣”的文献），详细阐述了每种策略的原理、技术细节、应用实例和取得的突破。特别是对人工智能辅助下发现非角鲨烯三萜合成新机制的深入介绍，突出了基础研究领域的重大进展。这篇综述为从事天然产物发现、合成生物学和代谢工程的研究人员提供了一份全面的技术路线图和未来研究方向指南，强调了跨学科技术整合对于突破天然产物发现瓶颈、加速其向应用转化的重要性。