学术研究报告：利用生物打印人iPSC来源的中胚层祖细胞生成自组织大血管结构
第一作者及机构、发表期刊与时间 本研究由Leyla E. Dogan、Nathaly A. Chicaiza-Cabezas、Florian Kleefeldt、Philipp Wörsdörfer、Jürgen Groll和Süleyman Ergün共同完成。主要研究机构包括德国维尔茨堡尤利乌斯·马克西米利安大学解剖学与细胞生物学研究所、功能材料与生物制造研究所功能材料系，以及土耳其伊斯坦布尔Atlas大学Atlas大学研究中心。该研究以研究文章形式发表于期刊《Advanced Science》，于2026年3月6日收稿，同年5月28日接受发表。
学术背景 本研究属于组织工程与再生医学领域，聚焦于血管化这一核心挑战。在组织工程中，构建具有功能性、可灌注的血管网络，特别是能够连接宏观宿主血管与组织内微血管网络的厘米级大血管，是实现大型、厚实组织或器官替代物的关键瓶颈。传统方法通常依赖于预分化的血管细胞（如内皮细胞、平滑肌细胞）与支架材料结合，但这些方法难以再现天然血管壁的多层结构（内膜、中膜、外膜）和体内观察到的分级网络组织，限制了其转化相关性。
受胚胎血管发育过程的启发，本研究团队提出了一种新的策略。在胚胎发育中，血管发生（vasculogenesis）由源自中胚层祖细胞的内皮细胞驱动，这些细胞自组织形成最初的毛细血管丛，并经过重塑形成包含大、小血管的层级化血管系统。基于此，研究团队先前已成功从人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）分化出中胚层祖细胞（human iPSC-derived mesodermal progenitor cells, hiMPCs），这些hiMPCs具有分化为所有血管壁所需细胞类型的潜力，并在挤出式生物打印后能够自组织形成具有层级结构的类血管构造。然而，仅靠其内在的自组织能力不足以形成直径大于1毫米、可用于功能性灌注或与宿主血管手术整合的大尺寸导管血管。
因此，本研究旨在克服这一限制。其核心目标是：利用3D生物打印技术，预先定义毫米至厘米尺度的“母血管”（mother vessel）结构，该结构旨在与周围预血管化组织（如类器官）的血管网络互连，并作为这些组织构建物的明确流入和流出通道。通过将生物打印与hiMPCs固有的自组织能力相结合，研究者希望建立一种受发育生物学启发的、能够桥接宏观与微观血管化的平台，为制造可灌注、血管化的大型组织构建物铺平道路。
详细研究流程 本研究是一个系统性的工程与生物学验证过程，主要包含以下几个关键步骤：
1. 细胞分化与生物墨水优化 * 研究材料与对象： 使用商业化人真皮成纤维细胞来源的hiPSCs，将其分化为hiMPCs作为所有实验的单一细胞来源。细胞密度为每毫升生物墨水2×10^7个细胞。 * 实验流程： * hiMPCs分化： 采用团队先前建立的2D培养方案，使用含有CHIR99021、BMP4等因子的中胚层诱导培养基，将hiPSCs分化为表达VEGFR-2和Brachyury标记的hiMPCs。 * 生物墨水配方开发与表征： 为获得兼具良好可打印性和支持血管形态发生能力的生物墨水，研究系统评估并优化了基于明胶甲基丙烯酰（gelatin methacryloyl, GelMA）的多种配方： * 基础配方： 仅猪源GelMA。 * 增强配方： GelMA + I型胶原（Col I），旨在改善细胞粘附。 * 优化配方1（FGX）： 鱼源GelMA + 猪源GelMA + 黄原胶。鱼源GelMA提供更低的凝胶温度以改善打印过程的热稳定性，黄原胶调节流变学特性以实现剪切变稀行为。 * 优化配方2（FGXC）： FGX + 纤维状I型胶原（fibrillar Col I），旨在增强机械稳定性和基质均质性。 * 表征方法： 对每种配方进行流变学测试（温度扫描、剪切速率扫描）、可打印性评估（丝融合测试、打印性指数分析）、机械性能测试（压缩模量）和微观结构分析（冷冻扫描电镜）。最终，FGXC配方因其在温度稳定性、剪切变稀流变学、机械鲁棒性（杨氏模量约13.4 kPa）和高打印保真度方面的综合优势被选为后续所有实验的最终生物墨水。
2. 嵌入式3D生物打印构建“母血管” * 研究材料与方法： 采用嵌入式生物打印策略。将hiMPCs悬浮于预热的FGXC生物墨水中，装入注射器。 * 实验流程： * 打印过程： 使用Cellink Bio X生物打印机，将细胞负载的生物墨水挤出到由黄原胶和透明质酸组成的粘弹性支撑浴中。支撑浴在打印过程中提供临时机械支撑，并在打印后通过冲洗温和释放构建物，而不破坏其结构。打印参数根据墨水优化（FGXC使用20G针头，室温，压力6-7 kPa，速度360 mm/min）。 * 交联与培养： 打印完成后，立即用405 nm光（54 mW/cm²）照射3分钟进行光交联，稳定管状结构。交联后的构建物从支撑浴中取出，用PBS冲洗，并转移到含有VEGF-A的血管生长培养基中，在静态条件下培养3至13天。 * 构建物尺寸： 可打印出内径3.5-4.5毫米、长度可达20毫米的管状结构。
3. 血管形态发生与血管壁形成的表征 * 研究设计： 在培养的不同时间点（第4、7、11、13天）对生物打印的“母血管”构建物进行系统的组织学和功能分析，以追踪血管发育的时间线。 * 实验与方法： * 细胞活力检测： 使用钙黄绿素AM/乙锭同型二聚体-1（Calcein AM/EthD-1）活/死染色评估打印后第1、3、7天的细胞存活率。 * 组织学与免疫荧光： 将构建物固定、石蜡包埋并切片，进行H&E染色、弹性纤维染色（间苯二酚-品红）以及针对多种标记物的免疫荧光染色，包括： * 内皮细胞： CD31， eNOS。 * 壁细胞/平滑肌细胞： α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）。 * 细胞外基质： III型胶原（Col3a1）， IV型胶原。 * 祖细胞/干细胞标记： CD34, CD150, CD44。 * 免疫细胞： Iba1（巨噬细胞/小胶质细胞）， CD45。 * 三维成像： 对整体构建物进行组织透明化处理，结合CD31和αSMA免疫荧光染色，进行共聚焦显微镜三维重建，以可视化血管网络的空间结构。 * 定量分析： 对血管壁厚度、管腔直径、中胚层组织厚度、内皮分支长度、CD31+覆盖面积、管腔内皮覆盖率等参数进行图像定量分析，并使用GraphPad Prism进行统计学检验（ANOVA， Tukey’s多重比较检验等）。 * 功能测试（单核细胞粘附实验）： 培养第10天，将“母血管”切开、展平，暴露管腔内皮表面。一组用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激48小时，对照组不加。然后与用Calcein AM标记的THP-1单核细胞共孵育1小时，洗涤后通过荧光显微镜成像并定量粘附的单核细胞数量，评估内皮细胞的炎症反应功能。
4. 与预血管化中胚层类器官的整合 * 研究设计： 为了模拟模块化血管化，将预血管化的中胚层类器官与生物打印的“母血管”进行共培养，评估其结构整合潜力。 * 实验流程： * 类器官生成： 使用定制化的琼脂糖微孔模具，从hiPSCs生成尺寸均一（约300微米）的预血管化中胚层类器官。类器官内部含有CD31+内皮细胞网络。 * 共培养： 将约750个培养第7天的类器官与一个培养第4天的生物打印“母血管”共同培养3天。 * 整合评估： 通过H&E染色、免疫荧光染色（CD31， αSMA， Col IV， Iba1等）观察类器官与“母血管”外壁的粘附、融合情况，以及两者血管网络之间的结构连接。
5. 灌注可行性验证 * 研究设计： 作为概念验证，评估“母血管”在生物反应器中承受流体灌注的能力。 * 实验流程： * 灌注室设计： 自主设计并3D打印了一个生物相容性树脂灌注室，可容纳并固定两个管状构建物。 * 灌注实验： 将培养第7天的“母血管”构建物两端夹在灌注室的流入和流出管上，使用蠕动泵以1 mL/min的脉动流速灌注含氧基础培养基。 * 评估指标： 观察构建物在灌注过程中是否发生泄漏，评估其机械稳定性和密封性。
主要研究结果 1. 生物墨水优化与打印成功： 流变学测试表明，FGXC生物墨水在室温下具有稳定的粘弹性行为和显著的剪切变稀特性，适合打印。可打印性测试显示其能形成连续、均匀的细丝。压缩测试证实FGXC的机械强度（~13.4 kPa）显著高于其他配方，接近软组织范围。冷冻电镜显示FGXC具有致密、均匀的纤维网络结构。使用FGXC和嵌入式打印方法，成功制造出厘米尺度、结构完整的“母血管”构建物，且打印后细胞活力保持在较高水平。
2. 自组织血管壁形成： 培养一周内，hiMPCs在构建物内自发分化并自组织，形成了具有三层结构的类血管壁。 * 内膜： CD31+和eNOS+的内皮细胞连续覆盖管腔内表面。 * 中膜： 在内皮下形成3-4层αSMA+的平滑肌细胞环状结构，类似血管中膜。 * 外膜/中胚层组织： 血管壁外是疏松的、血管化的中胚层样组织，其中包含CD31+的毛细血管样网络和αSMA+的周细胞。该组织内还检测到CD34+、CD150+、CD44+、CD45+的祖细胞以及Iba1+的巨噬细胞样细胞。 * 细胞外基质： 在血管壁内检测到III型胶原和弹性纤维的沉积，表明早期基底膜形成和细胞外基质重塑。 * 动态变化： 定量分析显示，血管壁厚度从第4天到第13天显著增加至约150微米。同时，打印时约3.5毫米的管腔直径随着培养时间推移逐渐缩小，至第13天几乎闭合。周围中胚层组织的厚度先增加后稳定。内皮网络在培养初期（至第7天）分支长度和覆盖面积增加，随后（第10天）覆盖面积减少，提示血管网络经历成熟和重塑过程。管腔内皮覆盖率从第3天到第10天逐渐增加，至第10天接近90%。
3. 内皮功能验证： 单核细胞粘附实验显示，经TNF-α刺激后，“母血管”管腔内皮细胞粘附的单核细胞数量显著增加，表明其内皮细胞具有类似体内的炎症激活反应功能。
4. 与类器官的模块化整合： 共培养实验表明，预血管化的中胚层类器官能够粘附并融合到“母血管”的外表面，形成连续的类组织覆盖层。免疫荧光显示，类器官内部原有的CD31+血管网络能够与“母血管”外壁中胚层组织内的血管网络发生空间上的连接，显示出结构整合的初步迹象。在融合的类器官层中也检测到αSMA+细胞、IV型胶原沉积和Iba1+细胞。
5. 灌注可行性： 在自制的灌注室中，对“母血管”进行脉动流（1 mL/min）灌注的初步实验表明，构建物能够承受流体压力而未发生可检测的泄漏，证明了其基本的机械稳定性和作为灌注通道的潜力。
结论与意义 本研究成功建立了一种利用生物打印hiMPCs单步生成厘米级、自组织“母血管”构建物的策略。所开发的FGXC生物墨水平衡了可打印性与生物相容性。打印后的构建物能在短期内（约1周）自发形成具有内膜、中膜和外膜/中胚层组织雏形的三层血管壁结构，并包含多种血管壁细胞和祖细胞，甚至出现了非血管系的巨噬细胞样细胞，高度模拟了胚胎期血管发育的关键过程。
该研究的科学价值在于：1）方法学创新：提供了一种受发育生物学启发的、基于单一祖细胞来源和自组织能力的宏观血管构建新范式，避免了使用预分化细胞的复杂性。2）结构仿生：生成的血管构建物在尺寸和结构层次上更接近天然血管，超越了大多数现有生物打印血管模型。3）模块化整合潜力：首次展示了生物打印的“母血管”与预血管化类器官模块在结构上的融合与血管网络互连，为实现层级化血管组织工程提供了概念验证。4）功能初步验证：证明了构建物内皮具有炎症反应功能，且能承受基础灌注，为其走向功能化应用奠定了基础。
其应用价值在于为解决组织工程中“血管化”这一核心瓶颈提供了新思路。通过“母血管”作为可灌注的宏观通道，连接宿主循环或外部生物反应器，同时利用其自身及周围融合组织的微血管网络为大型工程化组织提供营养和氧气，有望推动可移植、厚壁组织构建物的开发。
研究亮点 1. 单一细胞来源与自组织： 仅使用hiMPCs一种细胞，通过优化生物墨水和培养条件，使其在打印后自发分化并组织成复杂的三层血管结构，模拟了胚胎血管发生过程。 2. 厘米级宏观血管构建： 成功打印并培养出内径达数毫米、长度达厘米尺度的管状结构，突破了以往微血管网络或简单内皮化通道的尺度限制。 3. 创新的生物墨水配方（FGXC）： 通过复合鱼源/猪源GelMA、黄原胶和纤维状胶原，创造了一种兼具优异流变性、打印性、机械强度和支持细胞形态发生能力的生物墨水。 4. 模块化“生物砖”概念验证： 将生物打印的“母血管”与预血管化中胚层类器官共培养，实现了两者在组织水平和血管网络水平的结构性初步整合，展示了构建大型血管化组织的模块化组装策略。 5. 功能与结构兼备的分析： 不仅进行了详尽的组织学、免疫表型分析，还进行了内皮功能（单核细胞粘附）和机械功能（灌注实验）的测试，全面评估了构建物的性能。
其他有价值内容 研究团队自主开发了用于灌注实验的3D打印灌注室，展示了将生物打印构建物与定制化培养设备结合进行功能测试的工程能力。此外，研究中观察到的Iba1+巨噬细胞样细胞的出现，提示hiMPCs在该系统中具有向非血管细胞类型分化的潜力，这为研究血管发育中的免疫细胞参与或构建更复杂的组织微环境提供了有趣的新模型。研究者也指出，当前构建物的管腔在静态培养下会逐渐闭合，而未来的长期、优化灌注（引入脉动和剪切应力）有望进一步促进血管壁成熟、改善内皮屏障紧密性，并实现更高级的功能研究，如内皮依赖性血管舒张等。