本研究由来自Université Paris-Saclay, Univ Evry, CY Cergy Paris Université, CNRS, LAMBE的Nathan Meyer、Laura Ratinho、Bénédicte Thiebot、Benjamin Cressiot*、Juan Pelta*、Laurent Bacri，来自Dreampore S.A.S.的Sandra J. Greive，以及来自意大利Università di Roma Tor Vergata的Blasco Morozzo della Rocca和Mauro Chinappi共同完成。该研究以题为“Discrimination of Oxytocin, a Behavioral Neuropeptide Hormone, and Its Structural Variants by Nanopore”发表于《ACS Nano》期刊，出版时间为2025年7月29日。

该研究属于纳米生物传感与分析化学交叉领域。催产素（Oxytocin， OXT）是一种关键的神经肽激素，在社会联结、分娩、泌乳以及情绪调节中发挥核心作用。近年来，研究表明其与多种神经精神疾病（如抑郁症、精神分裂症、自闭症谱系障碍）密切相关，被视为潜在的生物标志物。然而，催产素在体内存在多种结构变体，例如C末端去酰胺化的催产素游离酸（Oxytocin-Free Acid, OXT-FA）。这些变体在受体结合与生物活性上可能截然不同，但其结构差异极其细微（例如OXT与OXT-FA仅相差一个酰胺基团，分子量仅差0.99 Da）。传统的检测方法，如免疫测定法（ELISA， RIA）存在抗体交叉反应性、批次差异大、基质干扰等问题；而质谱法虽精确，但样品前处理复杂、成本高昂，难以实现常规检测。这导致关于OXT及其变体在血液或脑脊液中生理浓度的研究结果相互矛盾，阻碍了其作为可靠生物标志物的临床应用。因此，亟需开发一种高分辨率、无需标记、且能实现单分子水平分析的新方法来精确区分和检测这些结构高度相似的肽段。本研究旨在探索和验证纳米孔（Nanopore）技术，特别是利用气单胞菌溶素（Aerolysin, Ael）纳米孔及其突变体，来实现对OXT及其结构变体（主要是OXT-FA）的高灵敏、高特异性区分与检测，并深入探究肽段二级结构（二硫键、β-转角）以及肽段-纳米孔相互作用（电泳力与电渗流的竞争）对检测信号的影响，从而为开发基于构象生物标志物的诊断工具铺平道路。

本研究的工作流程系统而详尽，可分为以下几个主要步骤： 首先，是研究体系与材料的构建。研究团队合成了核心分析物：天然OXT、OXT-FA，以及用于探究二级结构作用的突变肽段——去除二硫键的OXT-S和OXT-FA-S（将两个半胱氨酸替换为丝氨酸），以及进一步去除β-转角的OXT-S-A和OXT-FA-S-A（将脯氨酸替换为丙氨酸）。同时，制备了关键的传感元件：野生型气单胞菌溶素（Ael wt）纳米孔蛋白，以及两个旨在改变孔道内表面电荷和电渗流（Electroosmotic Flow， EOF）的突变体D222K和E258R（将酸性氨基酸残基分别突变为碱性氨基酸）。所有蛋白均在BL21 Ros 2细胞中表达，并通过镍柱亲和层析纯化，然后经胰蛋白酶激活形成功能性孔道。 其次，是单分子纳米孔电生理记录实验。实验采用经典的平面脂双层膜（由二植烷酰磷脂酰胆碱构成）体系，将纳米孔蛋白插入膜中，分隔两个充满电解液（通常为4 M KCl， 25 mM Tris， pH 7.4）的腔室（cis和trans）。分析物肽段被加入到两个腔室中。通过在trans侧施加正电压，驱动带正电的离子和肽段（如果机制允许）从cis侧向trans侧移动。当单个纳米孔形成后，施加一系列电压（30 mV 至 130 mV）进行记录。使用Axopatch 200B放大器、Digidata 1440采集卡和Clampex软件，以250 kHz采样频率和5 kHz贝塞尔滤波记录离子电流。当肽段进入或与孔道相互作用时，会部分阻塞离子流，产生特征性的电流阻断事件。 第三，是数据的自动化提取与分析。原始电流数据使用Igor Pro软件和自定义编写的程序进行处理。关键事件参数被自动识别和提取，包括：开放孔电流（I0）、平均阻断深度（dIb， 即(I0 – I_blockade_mean) / I0）、阻断持续时间（dwell time， tt）以及事件内的电流噪声。为确保统计稳健性，研究设定了严格的事件筛选标准（例如阻断深度>0.3，持续时间>120 μs），排除了电噪声或酶解产生的干扰事件。对于频率分析，对事件间隔时间的半对数分布进行单指数拟合。对于阻断深度和持续时间的分布，则分别使用高斯拟合和指数拟合来确定主要种群及其特征值。所有实验均至少重复两次，结果以平均值和标准差呈现。 第四，是分子动力学（Molecular Dynamics， MD）模拟。为了从原子层面理解实验观察到的现象（特别是电渗流的作用），研究团队进行了全原子MD模拟。模拟体系包含嵌入POPC脂双层中的Ael wt、D222K或E258R七聚体孔道，周围为1 M或4 M KCl溶液。使用NAMD软件和CHARMM36力场，在施加沿孔道轴向的恒定电场（模拟250 mV电压降）的条件下进行非平衡模拟。通过分析水分子和离子的净通量，直接计算了EOF的强度和方向。同时，模拟还给出了孔道内离子的平衡分布，以解释孔道的离子选择性和EOF产生的微观机制。此外，研究还通过一个简化的捕获模型，将EOF速度与电泳（Electrophoresis， EP）速度进行比较，从理论上解释了实验观察到的捕获频率特征。

本研究取得了一系列清晰且相互印证的重要结果： 在Ael wt纳米孔检测OXT与OXT-FA方面，研究发现在所有测试电压下，两种肽段均产生阻断事件，且阻断持续时间随电压升高而增加，表明它们并未发生易位，而是被捕获并滞留在孔道入口处。这是生物纳米孔分析短肽的典型行为。在中间电压（70 mV）下，OXT-FA显示出两个明显的阻断深度种群（0.38和0.41），而OXT仅显示一个（0.42）。研究将此归因于电荷差异：OXT-FA呈电中性，仅受从cis指向trans的EOF驱动进入并滞留于孔道；而OXT带正电，其受到的从trans指向cis的电泳力与EOF方向相反，这种对抗部分阻碍了其进入和滞留，从而可能掩盖了其潜在的构象差异信号。在高电压（130 mV）下，OXT也显现出两个种群（0.41和0.42），同时OXT-FA的两个种群分离更佳。这表明增强的EOF部分克服了OXT所受的反向电泳力，使其能更有效地进入孔道并被“感知”，从而提高了构象分辨能力。捕获频率分析显示，两者频率均随电压线性增加且数值相近，表明EOF是主导捕获过程的力量，肽段电荷差异不影响其被“吸入”孔道的概率。阻断时间分析显示，OXT-FA的阻断时间显著长于OXT，这反向印证了电泳力促进带正电的OXT从cis侧退出，从而缩短了其滞留时间。这些结果共同揭示，EOF主导捕获，而孔道内的动力学则由EOF与EP的复杂竞争决定。 在探究二级结构影响方面，通过使用突变肽段并在缓冲液中加入变性剂盐酸胍（Gdn-HCl），研究团队解构了信号来源。对于缺乏二硫键但保留β-转角的OXT-S和OXT-FA-S，在1 M Gdn-HCl中，它们仍然显示出两个阻断深度种群，与天然肽在非变性条件下的结果类似。这表明观察到的双种群信号很可能源于β-转角相关的构象变化，而非二硫键。为了证实这一点，进一步使用了同时缺乏二硫键和β-转角的OXT-S-A和OXT-FA-S-A。结果显示，这两种肽在相同条件下均只产生一个单一的阻断深度种群。这一关键实验直接证明，Ael wt纳米孔所检测到的OXT和OXT-FA的双构象信号，主要归因于肽段中由脯氨酸促成的β-转角构象的差异。 在使用Ael突变体改善区分能力方面，研究取得了显著进展。与Ael wt不同，D222K和E258R突变体在130 mV下，对OXT和OXT-FA均只产生一个阻断深度种群，且两者的值分离度大大提高（例如，在D222K孔中，OXT为0.48， OXT-FA为0.65）。这极大地简化了识别过程并提高了区分精度。更为重要的是，动力学行为发生了质的变化：阻断时间随电压先增后减，在超过某个阈值电压（OXT为60 mV， OXT-FA为40 mV）后急剧下降。这种行为模式的转变强烈暗示，在突变体孔道中，肽段在较高电压下发生了易位（穿过孔道），而不是像在wt孔中那样仅仅被捕获。这种易位行为的差异也部分归因于电荷：带负电的OXT-FA在较低的电压下就达到了易位阈值。这些结果表明，通过工程化改造纳米孔的内表面性质，可以调控肽段-孔道的相互作用模式，从而优化检测性能（如提高区分度、改变转运机制）。 在分子动力学模拟验证与机理阐释方面，模拟结果有力地支持了实验推论。首先，模拟确认了在正电压下，Ael wt、D222K和E258R孔道均产生从cis指向trans的EOF，这与实验观测到的主导捕获的EOF方向一致。尽管两个突变体引入了更多正电荷，但模拟显示其EOF强度与wt孔相似甚至略低，这与实验中三者捕获频率相近的观察相符。模拟还揭示了孔道内氯离子分布的变化，解释了孔道轻微的阴离子选择性以及EOF产生的微观电荷环境。最后，通过理论模型计算EOF速度与EP速度的比值（beo/ep），发现在实验条件下（4 M KCl），beo/ep约为4.5，即EOF的贡献显著强于EP。这从理论上完美解释了为何带不同电荷的OXT和OXT-FA具有近乎相同的捕获频率——因为EOF是主要驱动力。模拟与实验的结合，为纳米孔内复杂的分子传输物理提供了原子层面的深刻见解。

本研究的结论是，利用Aerolysin纳米孔技术，成功实现了对结构差异极其微小的神经肽激素催产素及其变体（OXT与OXT-FA）的单分子水平检测与高分辨率区分。研究不仅证明了该方法在区分单酰胺基团差异上的可行性，还深入揭示了肽段二级结构（特别是β-转角）是产生特征性电信号的关键因素。通过蛋白质工程手段构建的纳米孔突变体（D222K， E258R）进一步提升了区分能力，并改变了分析物在孔道内的动态行为（从捕获到易位）。结合分子动力学模拟，研究清晰地阐释了电渗流与电泳力在分析物捕获和传输过程中的竞争机制，为理性设计纳米孔传感器提供了理论基础。这项研究展现了纳米孔技术在分析构象生物标志物方面的巨大潜力，为未来开发用于神经精神疾病（如自闭症、精神分裂症）的、基于OXT及其变体检测的、高特异性、无标记的诊断工具开辟了新的途径。

本研究的亮点在于：第一，研究目标具有重要的临床前沿性：聚焦于神经精神疾病潜在生物标志物催产素及其难以区分的结构变体，直指当前临床检测的痛点。第二，方法学上的高灵敏度与创新性：利用Aerolysin纳米孔实现了单分子水平上对仅相差0.99 Da、一个电荷的肽段的区分，这是传统方法难以企及的。第三，机理探究的深度与系统性：不仅停留在检测现象，还通过精心设计的突变肽系列实验，明确了β-转角构象是产生检测信号的关键；并利用孔道突变体优化性能，结合分子动力学模拟，从物理原理上深刻揭示了电渗流与电泳力的竞争机制，形成了从表观现象到原子机理的完整证据链。第四，展示了纳米孔技术的应用灵活性：同一平台既能用于检测，又能用于研究分子的构象变化，还能通过蛋白质工程进行性能优化，体现了其作为多功能生物分子分析平台的强大潜力。

此外，研究还包含其他有价值的内容：例如，在混合样品中进行检测的实验，证明了该方法在实际复杂样品中同时识别OXT和OXT-FA的可行性；对不同肽段浓度与事件频率关系的验证，确认了检测的定量潜力。支持信息中提供的详细数据（如事件筛选标准、拟合示例、不同浓度下的频率图等）也增强了研究的可靠性和可重复性。