本研究报道了一项关于构建仿生梯度结构软骨类器官（biomimetic gradient-structured cartilage organoids, BGSC-organoids）并研究其用于软骨年轻化（rejuvenation）及其机制的最新原创性研究工作。该研究由Xiangwan Miao（上海交通大学医学院附属瑞金医院、上海交通大学医学院附属第九人民医院）、Keyu Kong、Kewei Rong、Kerong Dai、Anthony Atala（Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, USA）及Zuyan Lu（上海交通大学医学院附属第九人民医院）等多位作者组成的国际团队完成。研究成果以论文形式发表在学术期刊 Bioactive Materials 第59卷上，文章已于2025年12月29日被接受，并于2026年1月5日在线发表。这篇研究论文题为“construction of biomimetic gradient-structured cartilage organoids and mechanistic study of their application for cartilage rejuvenation”，旨在解决关节软骨修复领域中因软骨细胞衰老、干细胞样表型耗竭所导致的修复失败这一关键临床难题。

该研究的学术背景根植于组织工程和再生医学领域，尤其聚焦于骨关节炎（osteoarthritis, OA）的治疗。关节软骨由于缺乏血管和神经，且软骨细胞数量有限，自我修复能力极差。特别是在OA等病理状态下，关节内衰老的微环境会抑制软骨细胞的成软骨特性，导致修复失败。传统的二维（2D）培养无法复现体内软骨的三维（3D）结构、生化信号和力学微环境，且在扩增过程中容易导致软骨细胞去分化，丧失其表型。近年来，三维软骨类器官作为一种能够模拟体内软骨结构和复杂细胞相互作用的模型，显示出巨大的潜力。同时，“器官芯片”（organ-on-a-chip）技术能够整合灌注和力学刺激，为模拟体内关节微环境和测试潜在疗法提供了有力平台。因此，本研究旨在开发一种新型的仿生梯度结构软骨类器官培养系统，以重建软骨发育微环境，逆转软骨细胞的衰老状态，并探究其在模拟力学微环境下的保护作用机制，从而为关节再生提供一种有前景的新策略。

本研究的详细工作流程复杂而系统，可分为多个关键步骤。首先，研究团队构建了一种用于软骨年轻化的三维重编程系统。他们从过表达SOX9转录因子的人骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived stem cells, BMSCs）中分离出细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs），称为SBEVs。通过超速离心、透射电镜、纳米颗粒跟踪分析和蛋白质印迹等手段验证了SBEVs的形态、大小和标志物。同时，制备了脱细胞软骨细胞外基质（decellularized cartilage extracellular matrix, dCEM）水凝胶，保留了关键的生物活性成分如胶原和糖胺聚糖（glycosaminoglycans, GAGs）。将SBEVs负载于dCEM水凝胶中，形成了名为“dCSEV”的生物墨水（bioink）。初步实验证明，与2D培养和单纯的dCEM水凝胶相比，dCSEV水凝胶能显著促进老年人来源软骨细胞的增殖、迁移，减少衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）阳性细胞比例，并上调软骨特异性标志物（如SOX9, COL2, ACAN）的表达。

其次，利用微滴微流控（droplet microfluidic）技术，将软骨细胞封装在dCSEV生物墨水中，构建了仿生梯度结构软骨类器官（BGSC-organoids）。经过28天的培养，研究人员通过钙黄绿素-AM/碘化丙啶（Calcein-AM/PI）染色、5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（EdU）染色和扫描电镜（SEM）评估了类器官的细胞活力、增殖和超微结构。结果显示，BGSC-organoids形成了直径约683微米的微软骨结构，细胞扩增倍数高达76.74倍，显著高于传统的球体（spheroid）模型（40.46倍）。更重要的是，杨氏模量（Young’s modulus）测试显示BGSC-organoids的硬度与体内天然软骨组织非常接近。组织学染色（H&E, 番红O固绿）、免疫荧光染色（针对SOX9, PRG4, ACAN, COL2等）以及流式细胞术分析表明，BGSC-organoids成功形成了具有异质性（heterogeneous）的梯度结构，表达并分布着成熟的关节软骨标志物，其结构更接近于体内软骨组织。

第三，为了深入揭示BGSC-organoids促使软骨细胞年轻化的分子机制，研究团队对2D培养、软骨细胞球体和BGSC-organoids进行了单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）分析。通过生物信息学分析，他们鉴定了八个不同的软骨细胞亚群，包括：软骨粗细胞（cartilage progenitor cell, CPC）、增殖性软骨细胞（proliferative chondrocyte, ProC）、增殖效应软骨细胞（proliferating effector chondrocyte, ProEC）、稳态软骨细胞（homeostatic chondrocyte, HomC）、前纤维软骨细胞（prefibrocartilage chondrocyte, PreFC）、肥大软骨细胞（hypertrophic chondrocyte, HtC）、调节性软骨细胞（regulatory chondrocyte, RegC）和成纤维样软骨细胞（fibroblastic chondrocyte, FC）。分析发现，BGSC-organoids培养系统显著提高了CPC和ProC亚群的比例，同时降低了FC和RegC亚群的比例。伪时序（pseudotime）轨迹分析揭示了四条软骨细胞分化轨迹，并意外地发现了一条涉及CPC-ProC循环的轨迹，该轨迹对维持软骨细胞的干性（stemness）和增殖特性至关重要。基因集富集分析（GSEA）和CellChat分析表明，在BGSC-organoids中，细胞外基质-受体（ECM-receptor）相互作用，特别是胶原相关的相互作用，在CPC-ProC分化途径中占主导地位，并激活了ANGPTL、NECTIN、PDGF、PTN等信号网络。这为BGSC-organoids的年轻化效应提供了单细胞层面的证据。

第四，为了在体外模拟关节囊的力学微环境并测试BGSC-organoids的机械抵抗能力，研究团队构建了一个创新的“骨关节炎芯片”（osteoarthritis-on-a-chip, OAOC）模型。该模型通过3D静电纺丝生物打印技术（3D electrospinning bioprinting）构建了负载dCSEV水凝胶的多仿生软骨支架，并将其集成到一个具有循环力学刺激的微流控平台中。通过施加不同强度（0 MPa, 0.4 MPa, 0.8 MPa）的压力，以及结合炎症因子IL-1β（模拟OA病理状态），该OAOC模型成功模拟了生理和病理状态下的关节力学环境。实验结果显示，生理性压力（0.4 MPa）提高了细胞活力和软骨标志物（SOX9, COL2A1）的表达，而病理性压力（0.8 MPa + IL-1β）则显著降低了细胞活力，上调了OA相关标志物（如MMP3, MMP13）的表达。随后，将BGSC-organoids植入OAOC系统中接受机械刺激测试。结果显示，与2D细胞和传统球体相比，BGSC-organoids展现出更高的细胞活力、增殖能力以及软骨标志物的表达。纳米压痕（nanoindentation）测试和COMSOL Multiphysics力学模拟软件分析表明，BGSC-organoids具有独特的“外硬内软”的壳-核结构，这种类似拱形的结构能有效传递和分散外部压力，维持内部细胞的机械微环境稳定。此外，蛋白质释放动力学研究证实，BGSC-organoids具有缓释（sustained-release）特性，能持续释放软骨保护性因子。

第五，为了探究BGSC-organoids在力学刺激下发挥保护作用的分子机制，研究人员进行了RNA测序分析。结果显示，BGSC-organoids中与ECM-受体相互作用、ECM蛋白多糖合成、软骨发育、干性维持、长寿和氧化磷酸化相关的基因表达上调。其中，波形蛋白（vimentin）、14-3-3蛋白家族和FOXO3转录因子相关的通路被显著激活。免疫荧光染色和蛋白质印迹实验证实了Vimentin、14-3-3（特别是14-3-3β亚型）和FOXO3蛋白水平在BGSC-organoids中表达升高。进一步的分子对接（molecular docking）分析和结构预测（AlphaFold 3）表明，Vimentin可能与14-3-3β蛋白具有较强的结合亲和力。研究提出，生物力学刺激可能诱导了BGSC-organoids中细胞外基质的重塑，进而激活Vimentin/14-3-3复合物，该复合物促进了FOXO3的活化，从而调控软骨细胞的增殖、抗凋亡（如Bcl-2/Bax比例变化）和机械耐受能力。这构成了一个名为“力学诱导的Vimentin/14-3-3/FOXO3通路”的新机制。

第六，为了验证BGSC-organoids在体内的治疗效果，研究团队进行了两项动物实验。一是小鼠内侧半月板失稳（destabilization of the medial meniscus, DMM）手术诱导的OA模型。每周向关节腔内注射BGSC-organoids、软骨细胞球体或2D细胞。结果显示，与对照组相比，BGSC-organoids治疗显著减轻了关节炎症发热、提高了痛阈、改善了步态异常。Micro-CT和组织学分析显示，BGSC-organoids治疗减少了骨赘形成和软骨下骨硬化，降低了滑膜炎和OA严重程度（OARSI）评分，并增加了软骨中COL2A1、SOX9和增殖标志物Ki67阳性细胞的数量。二是大鼠针刺诱导的椎间盘退变（intervertebral disc degeneration, IVDD）模型。向退变的椎间盘内注射BGSC-organoids。结果显示，BGSC-organoids治疗有效维持了椎间盘高度和强度，减少了纤维环的纤维化和髓核组织的丢失，并上调了SOX9和聚集蛋白聚糖（Aggrecan, ACAN）的表达，同时下调了凋亡标志物caspase-3的表达。体内实验证实了BGSC-organoids在治疗OA和IVDD这两种与力学环境改变相关的退行性疾病中的潜力。

本研究的结论是，成功开发了一种结合了SBEVs和dCEM的生物墨水，并以此构建了BGSC-organoids培养系统。该系统能够有效模拟软骨微环境，逆转衰老软骨细胞的表型，促进软骨粗细胞和增殖性软骨细胞亚群的扩增。同时，所构建的OAOC芯片模型为体外模拟和测试提供了有力工具。BGSC-organoids展现出良好的机械抵抗能力和因子缓释特性，其作用机制与力学诱导的Vimentin/14-3-3/FOXO3信号通路的激活有关。动物实验证明，BGSC-organoids能在体内维持透明软骨样表型，延缓关节软骨和椎间盘的退变。因此，这项研究为关节再生提供了一种具有增强扩增能力和再生潜力的新型软骨类器官策略，具有重要的科学价值和应用前景。

本研究的亮点颇多：第一，研究方法的整合创新：创造性地将过表达SOX9的细胞外囊泡（SBEVs）疗法、脱细胞基质（dCEM）提供的仿生微环境、微流控技术构建的类器官以及3D生物打印的器官芯片（OAOC）等多个前沿技术平台整合到一个连贯的研究体系中，从材料、结构、功能到机制验证，形成了一个完整且强大的技术闭环。第二，单细胞测序揭示新机制：通过高分辨率的scRNA-seq，不仅细致描绘了软骨类器官内的细胞异质性，更重要的是发现了一条之前未被充分认识的“CPC-ProC”循环轨迹，并将其与类器官的年轻化效应联系起来，为理解软骨再生和稳态维持提供了新的细胞生物学见解。第三，构建了功能更完善的OAOC模型：与以往静态或简单力学加载的模型不同，本研究构建的OAOC结合了仿生基质、循环力学加载和炎症因子刺激，能更真实地模拟OA发生发展中复杂的病理生理环境，是一个更先进的人类疾病体外模型。第四，提出了新的分子信号通路：研究首次将力学刺激、细胞骨架蛋白Vimentin、适配蛋白14-3-3（特别是β亚型）和关键转录因子FOXO3联系起来，形成了一个新的信号轴（Vimentin/14-3-3/FOXO3），来解释BGSC-organoids在机械压力下的适应性和保护作用，为软骨力学生物学（mechanobiology）研究增添了新内容。第五，验证的疾病模型具有广泛性：研究不仅在小鼠OA模型中验证了疗效，还在大鼠IVDD模型中进行了验证，证明了BGSC-organoids策略对于不同部位（关节、椎间盘）但具有相似退变机制（衰老、力学失稳）的软骨相关疾病可能具有普适性的治疗潜力。第六，向临床转化迈出了重要一步：与直接使用干细胞相比，使用细胞外囊泡（EVs）作为治疗成分，可能规避了干细胞移植带来的安全风险（如成瘤性、免疫排斥），并且使用脱细胞基质降低了免疫原性，这些设计都增强了该策略未来临床转化的可行性。当然，作者也在讨论中指出了未来需要解决的挑战，如符合药品生产质量管理规范（GMP）的规模化生产、标准化质量控制、在免疫健全动物模型中的验证以及针对具体适应症的递送策略优化等。这些系统而深入的工作，使得本研究在软骨组织工程和再生医学领域具有显著的贡献和影响力。