本研究由Yujun Ye、Xuexin Xie、Yiming Bi、Qing Liu、Lingling Qiu、He Zhao、Chengyin Wang、Weifeng Zhu和Ting Zeng共同完成，作者单位包括广州医科大学附属中医医院脑病科、广州医科大学中西医结合学院、广州医科大学中西医结合研究所及广州医科大学中医睡眠研究所。该研究于2025年发表在《Free Radical Biology and Medicine》期刊上，题为《NRF2 alleviates acute ischemic stroke induced ferroptosis via regulating XCT/GPX4 pathway》。

学术背景

急性缺血性卒中（acute ischemic stroke, AIS）占所有卒中病例的70%，其病理机制涉及氧化应激、炎症反应和线粒体功能障碍等。铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性的程序性细胞死亡形式，以脂质过氧化和铁积累为特征，与AIS后的神经元损伤密切相关。核因子E2相关因子2（NRF2）是细胞内关键的抗氧化转录因子，通过调控下游靶基因（如SLC7A11/XCT和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4））的表达，参与铁代谢和氧化应激的调节。然而，NRF2如何通过XCT/GPX4通路缓解AIS诱导的铁死亡尚不清楚。本研究旨在揭示NRF2通过调控XCT/GPX4通路减轻AIS中铁死亡和氧化应激损伤的分子机制，为AIS治疗提供新靶点。

研究流程

研究分为体内和体外两部分，共包含以下关键步骤：

1. 动物模型构建与分组

   • 使用雄性C57BL/6小鼠（21-25 g）和NRF2基因敲除（NRF2−/−）小鼠，通过大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）手术建立AIS模型。
     
   • 实验分组：野生型（WT）假手术组、WT-MCAO组、NRF2−/−假手术组、NRF2−/− MCAO组，以及NRF2激动剂Oltipraz（10 mg/kg）、抑制剂ML385（30 mg/kg）和铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1, 10 mg/kg）干预组。
     

2. 神经功能评估与脑梗死体积分析

   • 采用Longa神经功能评分法评估术后24小时神经功能缺损程度。
     
   • 通过TTC染色测定脑梗死体积，ImageJ软件量化分析。
     

3. 组织学与超微结构观察

   • 透射电镜（TEM）观察海马神经元线粒体形态变化，确认铁死亡特征（如线粒体收缩、嵴减少）。
     
   • 苏木精-伊红（H&E）和尼氏染色（Nissl staining）评估皮层和海马神经元病理损伤。
     

4. 氧化应激与铁代谢指标检测

   • 测定脑组织中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）水平。
     
   • 普鲁士蓝染色（Perls staining）检测Fe³⁺沉积。
     

5. 分子机制研究

   • 免疫荧光和Western blot分析NRF2、XCT和GPX4的表达及定位。
     
   • 体外实验：在SH-SY5Y细胞中过表达或沉默NRF2，通过Erastin诱导铁死亡模型，检测细胞增殖（EdU assay）、活性氧（ROS）水平（DHE荧光）及XCT/GPX4通路变化。
     

6. 数据分析

   • 使用GraphPad Prism 9.0进行统计学分析，数据以均值±标准误表示，采用t检验或ANOVA比较组间差异。
     

主要结果

1. AIS诱导铁死亡与氧化应激

   • MCAO小鼠皮层血流（CBF）显著降低，海马神经元线粒体呈现铁死亡特征（如嵴断裂）。
     
   • 转录组分析显示，MCAO组铁稳态和谷胱甘肽代谢通路显著富集（图1d-e）。Fer-1干预可减少神经元坏死和Fe³⁺积累（图1g-h）。
     

2. NRF2调控铁死亡的关键作用

   • Oltipraz激活NRF2后，MCAO小鼠CBF恢复至800 PU（对照组600 PU），神经功能评分改善（图2e），同时MDA降低、GSH/SOD升高（图2h-j）。
     
   • 免疫荧光显示Oltipraz促进NRF2核转位，上调XCT/GPX4表达（图2l）。相反，ML385抑制NRF2后加重氧化应激和铁沉积。
     

3. NRF2缺失加剧铁死亡

   • NRF2−/−小鼠的XCT和GPX4表达显著下调（图3c-e），Fe³⁺沉积增加（图3f），但神经元尼氏体减少与梗死时间更相关。
     

4. 体外验证NRF2-XCT/GPX4轴

   • NRF2过表达抑制Erastin诱导的SH-SY5Y细胞铁死亡，表现为EdU阳性细胞增多、ROS减少（图4a-b），XCT/GPX4表达上调（图4c-d）。
     

结论与意义

本研究首次阐明NRF2通过激活XCT/GPX4通路减轻AIS后的铁死亡和氧化应激损伤。具体机制包括：（1）NRF2核转位上调XCT和GPX4表达，维持谷胱甘肽稳态；（2）抑制脂质过氧化和铁积累，保护神经元存活。该发现为AIS的治疗提供了新策略，即靶向NRF2-XCT/GPX4轴可能成为缓解缺血性脑损伤的有效途径。

研究亮点

1. 创新性机制：首次揭示NRF2-XCT/GPX4轴在AIS铁死亡中的核心调控作用。
   
2. 多维度验证：结合体内（MCAO模型、NRF2−/−小鼠）和体外（SH-SY5Y铁死亡模型）实验，数据支撑充分。
   
3. 转化价值：NRF2激动剂Oltipraz的神经保护效应为临床药物开发提供依据。
   

其他价值

研究还提示NRF2可能通过调节血脑屏障（BBB）完整性和线粒体功能发挥保护作用，未来可进一步探索其与神经炎症的关联。