脓毒症免疫调控新机制：4-辛基衣康酸通过激活Nrf2负向调控PD-L1的研究报告
一、 研究作者与发表信息
本研究由华中科技大学同济医学院附属协和医院的彭张（Peng Zhang）、王雅馨（Yaxin Wang）、杨文昌（Wengchang Yang）、尹玉平（Yuping Yin）、李成国（Chengguo Li）、马先锋（Xianxiong Ma）、施亮（Liang Shi）、李瑞东（Ruidong Li）和陶凯雄（Kaixiong Tao）共同完成，其中彭张和王雅馨为共同第一作者，陶凯雄和李瑞东为共同通讯作者。该研究以题为“4-octyl itaconate regulates immune balance by activating nrf2 and negatively regulating pd-l1 in a mouse model of sepsis”的研究论文形式，于2022年10月24日发表在 International Journal of Biological Sciences 杂志（2022年第18卷第16期）。
二、 学术背景与研究目标
脓毒症（Sepsis）是全球范围内死亡率和致残率均居高不下的重大健康挑战。尽管及时诊断和支持治疗至关重要，但有效的特异性治疗方法仍然有限。近年来研究表明，脓毒症的病理过程与免疫系统功能紊乱密切相关。在疾病早期，主要表现为过度的炎症反应（即“细胞因子风暴”）和氧化应激损伤；而在疾病后期，则常伴随严重的免疫抑制或“免疫麻痹”，导致继发性感染风险增加和死亡率上升。免疫检查点分子，尤其是程序性死亡受体1（PD-1）及其配体（PD-L1）通路的过度激活，被认为是脓毒症中免疫抑制状态的关键驱动因素之一。
另一方面，核因子E2相关因子2（Nrf2）是调控细胞抗氧化应激反应的核心转录因子，其在多种炎症性疾病中表现出抗炎作用。一种名为衣康酸（Itaconate）的代谢物，是三羧酸循环的衍生物，被证明具有显著的抗炎活性，其作用机制部分被认为是通过修饰KEAP1蛋白、激活Nrf2信号通路来实现。然而，Nrf2如何调控脓毒症中的免疫平衡，特别是其与PD-1/PD-L1这一关键免疫检查点通路之间的关系，尚不清楚。
基于此，本研究旨在深入探讨Nrf2信号通路在脓毒症免疫抑制损伤中的作用。具体目标是：利用4-辛基衣康酸（4-octyl itaconate, OI，一种细胞渗透性更强的衣康酸衍生物）作为研究工具，在小鼠脓毒症模型和体外细胞模型中，探究OI是否能通过激活Nrf2信号通路来抑制脂多糖（LPS）诱导的氧化应激和炎症反应，并阐明Nrf2对免疫检查点分子PD-L1表达的调控作用及其具体分子机制。
三、 详细研究流程
本研究采用“体内动物模型”与“体外细胞实验”相结合的策略，系统性地验证了科学假设。
流程一：OI在脓毒症小鼠模型中的保护作用评估 1. 研究对象与分组： 使用8周龄雄性C57BL/6小鼠，通过经典的盲肠结扎穿刺（Cecal Ligation and Puncture, CLP）手术建立脓毒症模型。小鼠被随机分为四组：假手术对照组（腹腔注射生理盐水）、CLP模型组、CLP+OI (25 mg/kg)治疗组、CLP+OI (50 mg/kg)治疗组，每组12只。 2. 处理方法： 术后立即腹腔注射相应药物，观察96小时内小鼠的存活率。另设实验，在术后24小时处死小鼠，收集样本进行后续分析。 3. 实验内容： * 生存分析： 记录并比较各组小鼠在不同时间点的累积存活率。 * 组织病理学评估： 取肝、肺组织进行H&E染色，评估组织损伤（如肝细胞变性、肺组织炎症浸润和肺泡结构破坏），并进行损伤评分。 * 肝功能检测： 采集血清，使用试剂盒检测丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平，评估肝功能损伤。 * 腹腔细胞分析： 收集腹腔灌洗液，通过流式细胞术计数中性粒细胞和单核/巨噬细胞的数量变化。 * 细胞因子检测： 采集血液，使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测血清中促炎因子（TNF-α, IL-1β, IFN-γ）和抗炎因子（IL-10）的浓度。
流程二：OI对巨噬细胞极化和氧化应激的体外影响 1. 研究对象： 小鼠巨噬细胞系RAW264.7。 2. 分组与处理： 分为对照组、LPS刺激组、LPS+OI处理组（62.5 µM和125 µM）。部分实验加入了活性氧（ROS）特异性抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为阳性对照。 3. 实验内容： * 巨噬细胞表型分析： 使用流式细胞术检测M1型标志物（CD86）和M2型标志物（CD206）的表面表达。通过蛋白质免疫印迹（Western Blot）检测M1型相关蛋白iNOS和M2型相关蛋白Arg-1的表达。 * 炎症因子检测： 收集细胞培养上清，用ELISA检测TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IL-10的分泌水平；并用Western Blot检测细胞内相应蛋白的表达。 * 氧化应激评估： 使用荧光探针DCFH-DA通过荧光显微镜和流式细胞术检测细胞内ROS水平。使用商业试剂盒测定细胞内总谷胱甘肽（GSH）水平和还原型/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）比值。
流程三：探究OI通过Nrf2通路减轻氧化应激损伤的机制 1. 研究对象与处理： 在RAW264.7细胞中，除基础分组外，引入Nrf2特异性激动剂叔丁基对苯二酚（tBHQ）和特异性抑制剂ML385，进行联合处理。 2. 实验内容： * ROS与GSH测定： 在加入上述激动剂/抑制剂的条件下，再次检测ROS、总GSH和GSH/GSSG比值，验证Nrf2通路的角色。 * Nrf2通路蛋白表达与核转位： 通过Western Blot检测Nrf2、其下游抗氧化蛋白（HO-1、NQO1）以及谷胱甘肽合成酶（GSS）的蛋白水平。通过免疫荧光染色观察Nrf2蛋白从胞浆向胞核的转位情况。 * 基因沉默验证： 使用针对Nrf2的小干扰RNA（siRNA）转染RAW264.7细胞，敲低Nrf2表达后，重复LPS和OI处理，检测上述氧化应激指标和相关蛋白表达，确认OI作用依赖于Nrf2。
流程四：探索Nrf2激活与PD-L1表达的相关性 1. 转录组测序分析： 对RAW264.7细胞（对照组、LPS组、LPS+OI组）进行RNA测序（RNA-seq）。通过全基因组表达分析和差异基因富集分析，寻找与免疫检查点相关的、受OI显著调控的基因。 2. 结果： 分析发现，编码PD-L1的基因CD274在LPS组中显著上调，而在LPS+OI组中显著下调。相关性分析显示Nrf2与CD274的表达呈显著负相关（97.6%）。这提示OI可能通过Nrf2负向调控PD-L1。
流程五：验证OI及Nrf2对PD-L1表达的调控 1. 蛋白与mRNA水平检测： 在RAW264.7细胞中，通过流式细胞术、Western Blot、实时定量PCR和免疫荧光，从多个层面验证LPS和OI对PD-L1蛋白及mRNA表达的调控作用。 2. ROS依赖性验证： 使用ROS抑制剂NAC处理细胞，发现NAC虽能清除ROS，但并不影响LPS诱导的PD-L1表达上调，提示PD-L1的调控是ROS非依赖性的。 3. Nrf2功能获得与缺失实验： * 功能缺失： 使用靶向Nrf2的短发夹RNA（shRNA）慢病毒感染RAW264.7细胞，构建稳定敲低Nrf2的细胞系。观察在Nrf2敲低后，OI对LPS诱导的PD-L1表达的抑制效应是否被削弱或逆转。 * 功能获得： 通过敲低Nrf2的负调控因子KEAP1（shKeap1）来间接激活/过表达Nrf2，观察其对PD-L1表达的抑制效应。 * 时间梯度实验： 检测LPS刺激不同时间点（0-72小时）后，RAW264.7细胞中PD-L1蛋白的表达动态。
流程六：阐明Nrf2转录抑制PD-L1的分子机制 1. 染色质免疫共沉淀测序： 对RAW264.7细胞（对照组、shKeap1组、LPS组）进行针对Nrf2和RNA聚合酶II（Pol II）的ChIP-seq分析。 2. 结果分析： * 结合位点鉴定： 发现Nrf2能特异性结合在CD274基因的内含子区域（特别是第6内含子）。在Nrf2激活（shKeap1）的条件下，该结合峰降低；而在LPS刺激下，结合峰显著增高。这提示Nrf2可能通过占据该位点抑制转录。 * Pol II招募分析： Pol II在CD274基因转录起始位点的结合峰在Nrf2激活组降低，表明Nrf2抑制了Pol II的招募。 * 基序分析： 通过Motif分析预测了Nrf2在CD274内含子中的三个潜在高亲和力结合序列。 * 报告基因实验： 构建包含CD274野生型或突变型（针对上述三个结合位点）内含子序列的荧光素酶报告基因载体，转染HEK293T细胞。结果显示，突变这些Nrf2结合位点后，报告基因活性增强，证实这些位点介导了Nrf2对CD274转录的抑制。
流程七：体内验证Nrf2对PD-L1的调控及治疗潜力 1. 动物模型验证： 通过尾静脉注射shNrf2慢病毒，在小鼠体内敲低Nrf2基因，然后提取其腹膜巨噬细胞进行体外LPS和OI刺激实验，通过流式、Western Blot和免疫荧光双标（F4/80/PD-L1）验证Nrf2在体内对巨噬细胞PD-L1表达的调控作用。 2. 靶向PD-L1的治疗实验： 建立CLP脓毒症小鼠模型，分组为：对照组、CLP组、CLP+抗PD-1抗体治疗组、CLP+抗PD-L1抗体治疗组。观察6天内小鼠的存活率，评估阻断PD-1/PD-L1通路对脓毒症预后的改善作用。
四、 主要研究结果
结果一：OI显著提高脓毒症小鼠生存率并减轻多器官损伤。 与CLP组相比，OI治疗（尤其是50 mg/kg剂量）能剂量依赖性地显著提高小鼠的96小时生存率。组织学分析显示，OI治疗明显减轻了CLP引起的肝细胞空泡变性、坏死和肺组织炎症细胞浸润、肺泡间隔增厚。血清ALT/AST水平显著降低，腹腔内募集的炎性细胞（中性粒细胞、单核/巨噬细胞）数量减少。血清细胞因子检测表明，OI在抑制促炎因子（TNF-α, IL-1β, IFN-γ）释放的同时，升高了抗炎因子IL-10的水平。
结果二：OI在体外促进巨噬细胞向M2型极化，抑制炎症和氧化应激。 在RAW264.7细胞中，OI抑制了LPS诱导的M1型标志物（CD86, iNOS）表达和促炎因子分泌，同时促进了M2型标志物（CD206, Arg-1）表达和抗炎因子IL-10分泌。更重要的是，OI能有效抑制LPS诱导的ROS爆发，并阻止细胞内GSH耗竭和GSH/GSSG比值下降，其效果与ROS抑制剂NAC相当。
结果三：OI通过激活Nrf2信号通路发挥抗氧化作用。 实验证实，Nrf2特异性激动剂tBHQ能模拟OI的抗氧化效应（降低ROS，升高GSH），而Nrf2抑制剂ML385则能拮抗OI的效应。Western Blot和免疫荧光显示，OI处理增强了Nrf2蛋白的核转位，并上调了其下游靶基因（GSS, HO-1, NQO1）的表达。通过siRNA敲低Nrf2后，OI对GSH合成的促进作用及其对下游抗氧化蛋白的诱导作用均被显著削弱，明确证实了OI的作用依赖于Nrf2。
结果四：RNA-seq揭示OI的免疫调节作用与PD-L1下调密切相关。 转录组分析显示，PD-L1（CD274）是受LPS显著上调、又被OI显著下调的关键基因之一，且其表达与Nrf2激活状态呈强负相关。这为研究OI/Nrf2调控免疫检查点提供了直接线索。
结果五：OI及Nrf2能负向调控PD-L1表达，且该过程不依赖于ROS。 在多个层面证实LPS上调RAW264.7细胞的PD-L1表达（mRNA和蛋白），而OI能有效抑制这一上调。使用NAC清除ROS并不影响LPS对PD-L1的诱导，说明调控是ROS非依赖性的。功能实验证明：过表达/激活Nrf2（shKeap1）能抑制PD-L1；敲低Nrf2则导致PD-L1基础水平和LPS诱导水平进一步升高，并且使OI对PD-L1的抑制作用几乎完全消失。时间进程实验显示PD-L1在LPS刺激后持续高表达至48-72小时。
结果六：ChIP-seq等实验阐明Nrf2直接结合并转录抑制PD-L1基因。 这是本研究的关键机制发现。ChIP-seq证实Nrf2蛋白直接结合在CD274基因的第6内含子区域。报告基因实验进一步证实，突变该区域预测的Nrf2结合位点，会解除Nrf2对报告基因活性的抑制。同时，ChIP-seq for Pol II显示，Nrf2的激活减少了Pol II在CD274启动子区的招募。这些证据共同表明，Nrf2并非作为经典的转录激活因子，而是通过直接结合到PD-L1基因的特定内含子区域，阻碍Pol II的招募和转录起始，从而发挥转录抑制因子的功能，负向调控PD-L1的表达。
结果七：体内实验验证了该通路并提示治疗潜力。 在体内敲低Nrf2的小鼠腹膜巨噬细胞中，OI抑制LPS诱导的PD-L1表达的能力丧失。最后，治疗实验证明，在CLP模型中使用抗PD-L1（或抗PD-1）抗体进行干预，可以显著提高脓毒症小鼠的生存率，这从治疗角度印证了靶向PD-L1通路在脓毒症中的价值，也为基于Nrf2激活（如使用OI）的治疗策略提供了应用前景。
五、 研究结论与价值
本研究的核心结论是：代谢物衣康酸的衍生物4-OI，通过激活Nrf2信号通路，在脓毒症中发挥双重保护作用。在疾病早期，通过增强细胞的抗氧化能力（促进GSH合成），减轻氧化应激和炎症风暴，保护组织器官；在疾病中晚期，则通过Nrf2直接结合并转录抑制免疫检查点分子PD-L1的表达，从而缓解脓毒症伴随的免疫抑制状态，恢复免疫平衡。
其科学价值在于： 1. 揭示了Nrf2调控免疫反应的新范式： 首次详细阐明了Nrf2能够作为PD-L1的转录抑制因子，以一种不依赖于其经典抗氧化功能的方式，直接调控关键免疫检查点。这拓展了对Nrf2生物学功能的认识，即它不仅是一个抗氧化/解毒反应的“主开关”，也是一个重要的免疫调节转录因子。 2. 阐明了衣康酸类代谢物在脓毒症中的多效性保护机制： 系统性地解析了4-OI从早期抗炎抗氧化到晚期调节免疫抑制的全过程作用链条，为将代谢免疫干预应用于脓毒症治疗提供了坚实的理论依据和具体的分子靶点。 3. 提出了脓毒症免疫调控的潜在新策略： 研究提示，激活Nrf2（例如使用衣康酸衍生物）可能成为一种同时针对脓毒症早期过度炎症和晚期免疫抑制的“一石二鸟”式治疗新思路。
六、 研究亮点
七、 其他
本研究得到了中国国家自然科学基金的资助。所有动物实验均遵循了所在机构的动物伦理委员会规定。作者声明无利益冲突。该研究为理解脓毒症复杂的免疫失衡机制提供了新的视角，并为开发基于代谢重编程和免疫检查点调节的脓毒症新型疗法奠定了重要的实验基础。