分子胶降解剂诱导的E3连接酶相互作用组全局交联分析：拓展靶标空间
主要作者及机构
本研究由Yali Xu、Wensi Zhao、Hui-Jun Nie、Jiamin Wang等共同完成，通讯作者为Jia Li、Minjia Tan和Xiao-Hua Chen。研究团队来自中国科学院上海药物研究所（State Key Laboratory of Drug Research）、同济大学医学院转化医学研究所（Translational Research Institute of Brain and Brain-Like Intelligence）等机构。论文发表于《Angewandte Chemie International Edition》2025年第64卷，DOI: 10.1002/anie.202505053。
学术背景
研究领域：靶向蛋白降解（Targeted Protein Degradation, TPD）是药物研发的新兴领域，分子胶降解剂（Molecular Glue Degraders, MGs）通过诱导E3连接酶与靶蛋白形成三元复合物，促进靶蛋白的泛素化及降解。然而，现有方法难以全面捕捉MG诱导的E3连接酶相互作用组（interactome），尤其是非降解性底物（non-degradative substrates）。
研究动机：传统方法（如化学蛋白质组学、免疫共沉淀）存在局限性：
1. 仅关注降解或泛素化事件，忽略早期蛋白-蛋白相互作用（PPIs）；
2. 细胞裂解环境破坏天然相互作用，且难以捕获弱/瞬时相互作用；
3. 邻近标记技术（如APEX）背景噪音高。
研究目标：开发一种基于遗传密码扩展技术（genetic code expansion）和质谱的活细胞全局交联策略，全面解析MG诱导的E3连接酶相互作用组，拓展靶标空间。
研究流程与方法
1. 技术开发与验证
- 核心方法：将光交联非天然氨基酸（unnatural amino acids, UAAs）插入E3连接酶CRBN的底物结合界面（如I152位点），包括：
- O-NBAK：特异性交联邻近赖氨酸；
- ABK：非特异性交联任意氨基酸。
- 实验流程：
- 细胞处理：HEK293T细胞表达CRBN-I152UAA，加入MG（如CC-885或DKY709），紫外激活交联；
- 复合物富集：Strep-Tactin磁珠纯化交联复合物；
- 质谱分析：数据非依赖采集质谱（DIA-MS）鉴定相互作用蛋白。
- 验证实验：
- 成功捕获已知底物GSPT1（CC-885诱导）和IKZF2（DKY709诱导）；
- 银染和Western blot证实交联效率（图2d-e）。
2. 应用至临床MG降解剂DKY709
- 新靶点发现：在HEK293T细胞中鉴定49个显著富集蛋白，包括锌指蛋白FIZ1（log2 FC=6.73）；
- 机制验证：FIZ1的降解依赖CRL4CRBN-蛋白酶体通路（图3d-e）。
3. 设计新型MG降解剂CM-2/CM-3
- 结构设计：基于CRBN-来那度胺复合物晶体结构，延伸核心 scaffold至相邻口袋（图4a-b）；
- 活性测试：CM-3对多发性骨髓瘤细胞MM.1S的IC50为8.7 nM（图4d）；
- 靶标鉴定：发现ZFP91、CK1α等新底物，其中ZFP91降解依赖泛素-蛋白酶体系统（图5f）。
4. 靶标分类与机制分析
- G-loop规则验证：80%富集蛋白含CRBN识别基序（如G-loop结构）；
- 非降解性底物：如MNAT1虽被泛素化但未被降解（图S3）。
主要结果
技术突破：
- 首次实现活细胞内E3连接酶相互作用组的全局交联分析，灵敏度较传统方法提升10倍（GSPT1富集比108:1）；
- ABK较O-NBAK覆盖更广，捕获56个新候选靶标（图2h）。
靶标拓展：
- CC-885：除GSPT1外，发现MNAT1等非降解性底物；
- DKY709：揭示FIZ1为临床相关新靶点；
- CM-2/CM-3：设计的新降解剂通过结构优化增强CRBN结合（IC50=269 nM）。
机制解析：
- 底物招募依赖CRBN表面口袋重塑（图4b）；
- 非降解性底物可能因泛素化不足或蛋白酶体识别失败滞留（图S3）。
结论与价值
科学价值：
- 提供MG降解剂作用机制的全局视角，揭示“降解-非降解”连续谱；
- 为CRBN底物识别规则（如G-loop）提供实验支持。
应用价值：
- 加速下一代MG降解剂开发（如针对ZFP91的CM-3）；
- 拓展TPD在癌症免疫治疗（如DKY709-FIZ1轴）中的应用潜力。
研究亮点
- 方法学创新：整合遗传密码扩展与交联质谱，克服传统技术短板；
- 靶标发现：首次报道FIZ1为DKY709的降解底物；
- 转化潜力：CM-3的强抗增殖活性（IC50<10 nM）具备临床开发价值。
其他价值：
- 公开数据集（Supporting Information）可供后续计算建模（如AlphaFold预测CRBN-底物界面）；
- 非降解性PPIs为开发蛋白稳定剂（如分子胶增强剂）提供新思路。
（全文约2000字）