二硫化钼纳米孔实现单氨基酸分辨率检测的技术突破

作者及发表信息
本研究由浙江大学化学系实验物理生物学实验室的Fushi Wang、Chunxiao Zhao、Pinlong Zhao等团队主导，通讯作者为Jiandong Feng。研究成果于2023年发表在*Nature Communications*期刊（DOI: 10.1038/s41467-023-38627-x）。

学术背景
蛋白质单分子测序是后基因组时代的重要挑战。传统技术如Edman降解（Edman degradation）和质谱（mass spectrometry）存在检测速度慢、读长短或低丰度蛋白定量困难等问题。纳米孔技术因在DNA测序中的成功应用被寄予厚望，但蛋白质测序面临两大难点：
1. 分辨率不足：20种氨基酸的化学差异远小于4种碱基，需亚道尔顿（sub-1 Dalton）级分辨率；
2. 易位控制困难：多肽链的异质电荷分布导致信号复杂。
本研究旨在通过原子级工程化的二硫化钼（MoS₂）纳米孔实现单氨基酸的直接识别，并探索其在翻译后修饰检测中的应用潜力。

研究流程与方法
1. 纳米孔设计与制备
- 材料选择：MoS₂纳米孔因其原子级厚度（~0.7 nm）和可调控的孔径（0.5–1.6 nm），敏感区域尺寸与单氨基酸匹配。
- 制备工艺：通过化学气相沉积（CVD）生长单层MoS₂薄膜，转移至氮化硅（SiNx）支撑膜，电化学蚀刻法钻孔，优化孔径至亚纳米级（补充图3）。

1. 实验系统搭建

   • 电生理检测：采用双室流动池（Ag/AgCl电极），在1 M KCl缓冲液（pH 7.8）中施加200–300 mV电压驱动氨基酸易位（图1a）。
     
   • 信号采集：Axopatch 200B放大器记录电流信号，10 kHz低通滤波，100 kHz采样频率。
     

2. 氨基酸识别实验

   • 样本设计：测试20种天然氨基酸（2 μM浓度），按电荷/疏水性分为5组（图2a–h）。
     
   • 关键参数：通过相对电流阻断（δI/I₀）和停留时间（δt）区分氨基酸（图1b–g）。例如，甘氨酸（G）、丙氨酸（A）的δI/I₀峰值分别为0.229±0.016和0.295±0.021（图1f），准确率达88.41%。
     
   • 异构体区分：亮氨酸（L）与异亮氨酸（I）质量相同（131.18 Da），但δI/I₀差异显著（图2d），识别准确率87.25%。
     

3. 深度学习辅助分析

   • 算法开发：自主设计SAANet（Single Amino Acids Identification Network），结合长短期记忆网络（LSTM）直接从电流信号中提取特征（补充图16）。
     
   • 性能验证：对化学基团差异仅0.99 Da的天冬氨酸（D）与天冬酰胺（N），识别准确率达81.21%（图3a）。
     

4. 翻译后修饰检测

   • 磷酸化识别：酪氨酸（Y）与磷酸化酪氨酸（p-Y）的δI/I₀差异显著（0.106±0.012 vs. 0.128±0.019），准确率80.67%（图4b），证明纳米孔可检测单氨基酸修饰。
     

主要结果与逻辑关联
1. 亚道尔顿分辨率：MoS₂纳米孔可区分质量差仅0.94 Da的氨基酸（如L与N，图3c），为迄今纳米孔最高分辨率。
2. 化学基团敏感性：羟基（-OH，17.01 Da）与氨基（-NH₂，16.02 Da）的微小差异可被识别（图3a–b）。
3. 电荷依赖性信号：带正电的赖氨酸（K）与精氨酸（R）需反转电压驱动，验证了信号机制的可控性（补充图21）。
4. 设备稳定性：单纳米孔可连续工作数十小时，记录超70,000次事件（补充图14）。

结论与价值
1. 科学意义：首次实现单氨基酸的直接纳米孔识别，分辨率突破1 Da，为蛋白质单分子测序奠定技术基础。
2. 应用前景：
- 蛋白质测序：结合酶控肽链易位技术（如ClpX、DNA解旋酶），有望实现全长蛋白测序；
- 翻译后修饰检测：可扩展至磷酸化、糖基化等修饰的高通量分析。
3. 技术普适性：原子级工程化纳米孔的设计思路适用于其他二维材料（如石墨烯）或生物纳米孔改造。

研究亮点
1. 分辨率创新：亚道尔顿级分辨率首次通过实验验证（图3）。
2. 方法学突破：SAANet算法直接解析原始电流信号，避免传统机器学习的特征提取偏差（补充图17–20）。
3. 多维验证：41个独立纳米孔设备验证结果可重复性（补充图6–10），分子动力学模拟支持实验结论（补充注释2）。

其他价值
- 专利布局：团队已申请中国（CN202210909213.0）与PCT（PCT/CN2023/088193）专利，涵盖氨基酸识别与修饰检测方法。
- 技术开源：SAANet代码公开（补充软件），促进领域内算法优化。

本研究通过原子级精度的纳米孔设计，为单分子蛋白质分析提供了革命性工具，其技术框架有望推动精准医学和生物传感领域的突破。