转录因子PRRX1沉默通过FKBP5-p38 MAPK轴调控过度线粒体自噬与铁死亡减轻心肌缺血/再灌注损伤的心脏保护潜力
主要作者与研究机构
该研究由Yongpeng Fang（宁夏医科大学总医院老年病科）、Xudong Niu（银川市妇幼保健院内科）、Weifang Zhao（青岛大学附属青岛中心医院/青岛肿瘤医院心功能检查室）以及通讯作者Huali Zhang（甘肃省中医院体检中心）共同完成。研究成果发表于Elsevier旗下期刊《BBA - Molecular Basis of Disease》，于2025年3月3日在线发表，文献号为167766。
研究背景与科学问题
心肌缺血/再灌注（myocardial ischemia/reperfusion, I/R）损伤是急性心肌梗死等缺血性心脏病中至关重要的病理过程，具有较高的发病率与死亡率。尽管预防与治疗手段不断改进，但针对心肌I/R损伤的有效策略仍然缺乏。大量研究表明，过度线粒体自噬（mitophagy）与心肌细胞铁死亡（ferroptosis）是心肌I/R损伤发病机制中的两个重要特征。转录因子（transcription factors, TFs）通过转录调控其靶基因参与包括心脏疾病在内的多种人类疾病，其中许多转录因子可调控线粒体自噬与铁死亡。配对相关同源框蛋白1（paired-related homeobox 1, PRRX1）是配对同源框家族的重要转录因子，在肿瘤上皮-间质转化中具有密切关联，且在缺血性卒中的I/R损伤中表达升高并发挥损伤作用。此外，PRRX1与心肌纤维化及心血管疾病中的心肌损伤相关。然而，PRRX1是否以及如何调控心肌I/R损伤中的过度线粒体自噬与心肌细胞铁死亡仍不清楚。FK506结合蛋白5（FK506 binding protein 5, FKBP5）与应激相关疾病密切相关，并在脑缺血性卒中中通过自噬加重细胞损伤，但其在心肌I/R损伤中的作用尚未明确。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路，尤其是p38 MAPK，在心脏病等人类疾病中响应多种应激刺激，并与心肌细胞损伤中的自噬和铁死亡相关。因此，本研究旨在探讨PRRX1沉默对心肌I/R损伤的作用，并阐明其是否通过FKBP5与p38 MAPK信号轴发挥作用。
研究设计与实验流程
本研究采用体外与体内模型相结合的策略，系统解析PRRX1在心肌I/R损伤中的功能与机制。体外实验以人AC16心肌细胞为研究对象，通过氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation and reperfusion, OGD/R）处理模拟心肌I/R损伤，并根据复氧时间设置6小时、12小时和24小时组，最终选择引起PRRX1表达升高最显著的24小时复氧时间点进行后续实验。体内实验以8周龄雄性Sprague Dawley大鼠为研究对象，随机分为假手术组（sham）、I/R组、I/R+sh-con组和I/R+sh-prrx1组，每组5只。心肌I/R模型通过结扎左前降支（left anterior descending branch, LAD）30分钟后复灌4小时建立，并通过ST段抬高及结扎区域变白确认缺血成功。sh-prrx1或sh-con在I/R诱导前2天通过体内jetPEI试剂注射至左室前壁实现基因沉默。
在分子机制探索方面，研究者首先从GSE4105和GSE57338两个基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）中获取心肌I/R损伤相关的差异表达基因，并与人类转录因子数据库比对，鉴定出PRRX1和SMAD1两个候选转录因子，其中PRRX1上调更显著，因此被选为进一步研究对象。随后，利用比较毒理基因组学数据库（Comparative Toxicogenomics Database, CTD）获取PRRX1的12个下游靶基因，通过siRNA沉默PRRX1后在OGD/R处理的AC16细胞中检测这些靶基因的表达变化，发现FKBP5是唯一随PRRX1沉默而下调的靶基因。JASPAR数据库用于获取PRRX1基序（motif）及FKBP5启动子区的潜在结合位点，并通过双荧光素酶报告基因实验验证PRRX1对FKBP5启动子的转录激活作用。进一步通过CTD数据库获取FKBP5的237个下游靶基因，与I/R相关基因列表取交集得到114个重叠基因，经京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析发现MAPK信号通路显著富集。通过Western blotting检测p-p38/p38水平变化，并利用p38 MAPK抑制剂SB202190验证该通路在PRRX1/FKBP5轴下游的功能。
线粒体自噬的评估采用多种方法：JC-1染色检测线粒体膜电位，ATP检测试剂盒测定ATP含量，免疫荧光染色观察LC3与MitoTracker共定位，Western blotting检测LC3 II/I和p62蛋白表达。铁死亡的评估则包括乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放实验、活性氧（reactive oxygen species, ROS）检测、Fe²⁺含量测定、谷胱甘肽（glutathione, GSH）含量测定以及Western blotting检测谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）和酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4, ACSL4）蛋白水平。体内实验中，心肌梗死面积通过2,3,5-三苯基四唑氯化物（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC）染色评估，血清肌酸激酶同工酶（creatine kinase-myocardial band, CK-MB）水平通过ELISA检测，PRRX1与FKBP5的组织表达通过免疫组织化学染色检测，线粒体自噬及铁死亡相关蛋白通过Western blotting检测。
主要研究结果
研究结果显示，PRRX1在OGD/R处理的AC16细胞中表达显著上调，且在24小时复氧时升高最为明显。PRRX1沉默可显著缓解OGD/R诱导的过度线粒体自噬，表现为线粒体膜电位恢复、ATP含量增加、LC3与线粒体共定位减弱、LC3 II/I比值降低以及p62蛋白水平升高；而PRRX1过表达则加剧这些损伤指标。在铁死亡方面，PRRX1敲低可减少LDH释放、降低ROS与Fe²⁺水平、提高GSH含量、上调GPX4并下调ACSL4，从而抑制OGD/R诱导的心肌细胞铁死亡；PRRX1过表达则产生相反效果。
在机制层面，PRRX1可通过转录激活FKBP5发挥作用。双荧光素酶报告基因实验证实PRRX1能显著增强野生型FKBP5启动子的荧光素酶活性，而对突变型无影响。FKBP5在OGD/R处理后的AC16细胞中表达升高，且PRRX1过表达可上调FKBP5，PRRX1沉默则下调FKBP5。进一步研究发现，OGD/R处理后p38 MAPK磷酸化水平显著升高，PRRX1沉默可降低p-p38/p38水平，而FKBP5过表达可逆转这一抑制效应，SB202190则能阻断FKBP5过表达引起的p38 MAPK激活。功能回复实验表明，FKBP5过表达可逆转PRRX1沉默对线粒体自噬和铁死亡的抑制作用，而p38 MAPK抑制剂SB202190能够消除FKBP5过表达的逆转效应。在体内实验中，PRRX1敲低可显著减少心肌梗死面积、降低血清CK-MB水平，同时降低心肌组织中LC3 II/I、ACSL4和p-p38/p38水平，升高p62与GPX4水平，并抑制PRRX1与FKBP5的表达。
结论与意义
本研究首次证实PRRX1沉默通过转录抑制FKBP5表达、阻断p38 MAPK信号通路激活，从而减轻OGD/R诱导的过度线粒体自噬与心肌细胞铁死亡，并在大鼠心肌I/R模型中发挥心脏保护作用。该研究不仅揭示了PRRX1/FKBP5/p38 MAPK这一新的调控轴在心肌I/R损伤中的关键作用，也为心肌I/R损伤的临床治疗提供了潜在分子靶点。从科学价值而言，该研究拓展了对转录因子在心肌I/R损伤中线粒体自噬与铁死亡调控网络的认识；从应用价值而言，靶向抑制PRRX1可能成为减轻心肌I/R损伤的新策略。
研究亮点
本研究的亮点在于首次阐明了PRRX1在心肌I/R损伤中通过FKBP5-p38 MAPK轴同时调控过度线粒体自噬与铁死亡的双重机制。研究整合了GEO数据库、CTD数据库和JASPAR数据库进行靶基因预测与通路富集，并结合体外功能回复实验与体内动物模型验证，形成了从生物信息学预测到实验验证的完整证据链。此外，研究使用了OGD/R细胞模型与大鼠心肌I/R模型相互印证，增强了结论的可靠性。PRRX1作为潜在治疗靶点的提出，为后续药物开发与临床转化提供了新的方向。