学术研究报告：基于ABCA4基因突变的Stargardt病视网膜类器官单细胞转录组研究

一、研究团队与发表信息
本研究由复旦大学附属眼耳鼻喉科医院的Yingke Zhao、Yun Cheng、Ting Li等团队完成，通讯作者为Shenghai Zhang与Jihong Wu。论文于2025年发表在《Scientific Data》（DOI: 10.1038/s41597-025-05079-5），标题为《Longitudinal scRNA-seq of retinal organoids derived from Stargardt disease patient with ABCA4 mutation》。

二、学术背景与研究目标
Stargardt病（STGD1）是一种由ABCA4基因突变引发的遗传性视网膜变性疾病，占遗传性视网膜疾病的17%以上。ABCA4基因编码的转运蛋白负责清除光感受器细胞中的毒性双视黄醛，其突变会导致毒性代谢物积累和视网膜退化。尽管已有多种小鼠模型用于研究，但小鼠缺乏人类特有的黄斑结构，限制了其病理模拟能力。因此，本研究利用患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）构建视网膜类器官（retinal organoids, ROs），结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，旨在揭示ABCA4突变在人类视网膜发育中的分子机制，填补疾病模型的空白。

三、研究流程与方法
1. 样本获取与iPSCs重编程
- 研究对象：一名22岁中国男性STGD1患者（携带ABCA4基因Asn965Ser/Arg18Pro突变），采集外周血单核细胞（PBMCs）。
- 重编程：使用Cytotune™ Sendai病毒将PBMCs转化为iPSCs，并通过碱性磷酸酶染色、核型分析和多能性标志物（Nanog、SSEA4）验证其质量。

1. 视网膜类器官分化与验证

   • 分化流程：iPSCs经胚胎样体（EBs）阶段诱导为神经外胚层，添加BMP4促进视网膜命运，最终形成3D视网膜类器官（ROs）。
     
   • 时间点：选取发育关键期（40、90、150、200、260天）进行形态学（光镜）和免疫荧光验证（标志物：Crx、HuC/D、Ki67等）。
     

2. 单细胞RNA测序与数据分析

   • 样本处理：酶解ROs为单细胞悬液，通过10x Genomics Chromium平台构建文库，Illumina NovaSeq 6000测序。
     
   • 数据分析：
     
     • 质控：过滤低质量细胞（基因数<200或线粒体基因占比>15%）。
       
     • 整合与聚类：使用Seurat（v5.1.0）进行批次校正、PCA降维和UMAP可视化，基于标志基因注释细胞类型（如光感受器、视网膜神经节细胞等）。
       

四、主要研究结果
1. 类器官发育特征
- 形态学：ROs在40天形成神经上皮外层，90天出现内核层，150天后显示光感受器突起（图2a）。
- 免疫荧光：ABCA4突变ROs的视锥细胞数量显著减少（图2b），且突触结构呈点状而非正常的“马蹄形”（图2c-f），提示突变影响光感受器形态。

1. 单细胞转录组发现

   • 细胞组成：发育早期以视网膜祖细胞（RPCs）为主，后期光感受器（视杆/视锥）占比增加（图4a）。
     
   • 突变效应：ABCA4突变导致光感受器转录异质性，视锥细胞标志物（PDE6H、THRB）表达下调，与临床病理一致。
     

2. 数据质量与验证

   • 测序指标：各时间点数据均通过质控（Q30>90%，基因组比对率>92%），细胞中位数基因数3349-4000（表1-2）。
     
   • 技术验证：UMAP显示细胞聚类与发育时间点高度相关（图3d-e），标志基因表达谱与已知视网膜发育规律吻合（图4b-c）。
     

五、研究结论与价值
1. 科学意义
- 首次在单细胞层面解析了ABCA4突变导致的视网膜发育异常，揭示了视锥细胞特异性损伤的分子基础。
- 建立了首个STGD1人源类器官-scRNA-seq联合模型，克服了小鼠模型缺乏黄斑的局限性。

1. 应用价值
   
   • 为STGD1的机制研究和药物筛选提供了高通量平台（如靶向毒性代谢物积累的疗法）。
     
   • 公开数据集（NCBI SRA: SRP554832）和代码（Figshare DOI: 10.6084/m9.figshare.27999230）促进领域内数据复用。
     

六、研究亮点
1. 技术创新：结合长期RO培养（260天）与多时间点scRNA-seq，动态追踪疾病进展。
2. 临床相关性：选用中国患者常见突变（Asn965Ser/Arg18Pro），增强研究成果的族群适用性。
3. 跨学科方法：整合干细胞生物学、单细胞组学和生物信息学，为复杂遗传病研究提供范式。

七、其他价值
研究还发现ABCA4突变可能通过影响纤毛结构（ARL13B表达异常）导致光感受器功能障碍（图2g），为未来治疗靶点开发提供了新方向。