该研究由来自意大利Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM)、那不勒斯费德里科二世大学、坎帕尼亚大学、荷兰拉德堡德大学医学中心等多个研究机构的Patrizia Tornabene、Ivana Trapani等学者共同完成。研究成果以论文“Intein-mediated protein trans-splicing expands adeno-associated virus transfer capacity in the retina”为题，于2019年5月15日发表在期刊 Science Translational Medicine 上。
本研究属于视网膜基因治疗领域，具体聚焦于扩大腺相关病毒载体的递送容量。腺相关病毒（AAV）载体是目前视网膜基因治疗最安全有效的工具，已有一款基于AAV的治疗遗传性失明的产品于2017年获批。然而，AAV载体的一个主要限制是其有限的“货物”容量（通常不超过5 kb），这阻碍了其用于治疗那些由大基因（如ABCA4和CEP290，分别导致斯塔加特病和莱伯氏先天性黑蒙10型）突变引起的遗传性视网膜疾病。此前，克服此限制的策略包括使用双AAV或三AAV载体，通过载体基因组在细胞内的头尾连接和重组来重建全长基因。但这种方法在光感受器细胞中的转导效率低于单AAV载体，可能受限于DNA多联体形成、mRNA稳定性及剪接效率等多个环节。
本研究利用了一种名为“分裂内含肽”的蛋白质剪接元件。内含肽是存在于单细胞生物中的遗传元件，在翻译后能自我从前体蛋白中精确切除，并将两侧的外显肽连接起来。分裂内含肽是内含肽的一个亚类，由两个分开表达的肽段组成，可以介导“反式蛋白质剪接”，将两个独立的蛋白质片段连接成一个完整的、更大的蛋白质。该团队旨在利用分裂内含肽的这一特性，将大蛋白的编码序列分割成两个或三个片段，分别装入单个AAV载体（称为AAV内含肽载体），递送至视网膜细胞后，通过蛋白质反式剪接在蛋白水平（而非DNA或RNA水平）重建出有功能的全长治疗性蛋白。
研究流程系统而全面，涵盖了从概念验证到临床前疗效评估的多个阶段，使用了体外细胞、小鼠、猪以及人视网膜类器官等多种模型。
1. 概念验证与载体构建： 研究人员首先选择增强型绿色荧光蛋白作为报告基因，构建了双AAV内含肽载体系统。每个载体分别编码EGFP蛋白的N端或C端一半，该半段蛋白与来自点形念珠藻的DnaE split intein的N端或C端部分融合。载体包含必要的调控元件（启动子和polyA信号）以及用于检测的3xFlag标签。在体外转染人胚胎肾细胞实验中，只有当同时转染两个AAV内含肽质粒时，才能通过Western blot检测到全长EGFP蛋白以及被切除的完整内含肽，并通过液相色谱-质谱分析证实了拼接点序列与野生型EGFP完全一致，证明了蛋白质反式剪接的准确性和可行性。
2. 效率比较与优化（体外及小动物模型）： 在确定了基本原理可行后，研究在多个层面比较了AAV内含肽系统与传统的单AAV、双AAV系统的效率。在HEK293细胞中，AAV内含肽系统产生的EGFP蛋白量约为单AAV的一半，但比双AAV系统高8倍。随后，研究在小鼠体内展开。通过视网膜下注射AAV2/8载体（使用广谱CMV启动子或光感受器特异性GRK1启动子），发现AAV内含肽系统能在小鼠视网膜色素上皮和光感受器中成功重建EGFP，其蛋白产量虽然低于单AAV，但比双AAV系统高约3倍。
3. 大动物模型及人类视网膜类器官验证： 为了推进临床转化，研究在更接近人类的大型动物模型——猪的视网膜中进行了验证。视网膜下注射结果显示，AAV内含肽系统在猪光感受器中重建的EGFP蛋白量达到了与单AAV载体相似的水平，并且比双AAV系统高约3倍。此外，研究还利用人诱导多能干细胞来源的三维视网膜类器官这一新型人源化模型进行验证。感染了AAV内含肽载体的类器官显示出明显的EGFP荧光，证明了该系统在人类视网膜组织中的有效性。
4. 大治疗性蛋白（ABCA4和CEP290）的载体设计与优化： 核心挑战在于将分裂内含肽技术应用于实际的治疗性大蛋白。研究选择了导致斯塔加特病的ABCA4和导致莱伯氏先天性黑蒙10型的CEP290基因。设计时需综合考虑两个因素：一是拼接点氨基酸残基（外显肽）必须满足高效蛋白质剪接的要求（特别是C-外显肽的第一个残基需为Cys、Ser或Thr）；二是分割点必须避开蛋白质的关键功能结构域，以保证每个独立片段以及最终重建蛋白的正确折叠和稳定性。 研究团队为每个蛋白设计了多个分割方案（“组”）。对于ABCA4，主要测试了双片段分割的不同方案。对于更大的CEP290，为了能在每个AAV载体中容纳更强的启动子或转录后调控元件以增强表达，他们设计了三片段分割方案。为了防止第一和第三片段之间发生非预期的错误剪接，他们在两个拼接点使用了不同种类的、且不相互交叉反应的分裂内含肽（DnaB intein 和 野生型/突变型 DnaE intein）。通过转染实验比较各组效率，筛选出效率最高的构建体（ABCA4的组1和CEP290的组5）用于后续研究。通过免疫荧光和共聚焦显微镜观察，确认了单个蛋白片段以及共表达时的亚细胞定位与全长蛋白的已知定位基本一致，例如ABCA4片段主要位于内质网，CEP290的不同片段则分别呈现点状（与膜结构相关）或纤维状（与微管结合）分布，表明片段能正确定位，有利于反式剪接的发生。
5. 治疗性蛋白在视网膜中的表达与功能验证： 接下来，研究在小鼠、猪视网膜以及人视网膜类器官中验证了AAV内含肽系统递送ABCA4和CEP290的能力。视网膜下注射结果显示，AAV内含肽系统比双AAV系统更高效地在野生型小鼠和猪的视网膜中重建出全长ABCA4和CEP290蛋白。在源自斯塔加特病患者的视网膜类器官中，AAV内含肽系统也能成功表达ABCA4蛋白。更重要的是，在疾病模型小鼠中进行了功能拯救实验。在Abca4敲除小鼠（斯塔加特病模型）中，视网膜下注射AAV-ABCA4内含肽载体3个月后，视网膜色素上皮中脂褐素（一种疾病标志性积累物）的面积显著减少。在rd16小鼠（CEP290突变导致的莱伯氏先天性黑蒙模型）中，注射AAV-CEP290内含肽载体1个月后，光感受器外核层厚度得到显著保护，同时基于瞳孔光反射的功能测试也显示治疗组小鼠的瞳孔收缩能力显著优于对照组。这些结果表明，通过内含肽系统重建的蛋白具有生物学功能，并能改善疾病表型。
6. 安全性初步评估： 研究还对AAV内含肽载体的安全性进行了初步评估。在野生型小鼠中注射治疗性AAV内含肽载体后，通过全视野视网膜电图和光学相干断层扫描分别检测视网膜电生理功能和结构，结果显示治疗组与对照组无显著差异，表明在观察期内（最长6个月）未发现明显的视网膜毒性迹象。
本研究得出结论：利用分裂内含肽介导的蛋白质反式剪接，结合AAV载体的视网膜下递送，是一种能够有效克服AAV载体容量限制的新策略。该策略能够在多种临床前模型（包括人视网膜类器官）中重建大治疗性蛋白，并改善遗传性视网膜疾病动物模型的病理表型。
科学价值： - 提出并验证了一种全新的、在蛋白质水平上扩大AAV递送容量的通用策略，与传统的基于DNA/RNA重组的双/多AAV策略形成互补。 - 为治疗由ABCA4、CEP290等大基因突变引起的遗传性失明提供了具有高度转化潜力的基因治疗工具。 - 证明了在复杂的人体组织（视网膜类器官）中应用蛋白质工程元件（内含肽）进行基因治疗的可行性。
应用价值： - 直接推动了大基因相关视网膜疾病（如斯塔加特病、莱伯氏先天性黑蒙10型）的基因治疗药物研发进程。 - 该平台技术可扩展应用于其他因基因过大而难以用传统AAV载体治疗的遗传性疾病。
研究也指出了该技术当前的一些局限性，体现了科学研究的客观性： - 载体设计更复杂： 与双AAV相比，AAV内含肽载体的设计更受限制，需同时考虑蛋白结构域和剪接效率，且每个载体都需包含完整的调控元件，占用部分容量。 - 存在副产物： 系统中会产生未被剪接的单个蛋白片段、部分剪接的中间体以及被切除的内含肽。尽管初步安全性数据显示这些副产物未见明显毒性，但其长期影响仍需评估。作者也提出了未来可通过调节不同载体的剂量比例或设计可降解的内含肽来优化系统。 - 大治疗性蛋白的表达效率相对较低： 与EGFP相比，ABCA4和CEP290等大蛋白的重建效率相对较低，提示大而复杂的治疗性蛋白可能面临更多折叠和加工方面的挑战。
这项研究是视网膜基因治疗领域的一项重要进展，它通过巧妙的蛋白质工程技术，为解决AAV载体容量限制这一长期难题提供了高效的新方案，为众多因大基因突变致盲的患者带来了新的希望。