近日，西班牙卡丹纳尔·埃雷拉大学（CEU Universities）的P. J. Marín-García博士团队与丹麦奥胡斯大学等机构的合作者在《通讯-生物学》（Communications Biology）期刊上，发表了一项关于蠵龟（Caretta caretta）性别特异性代谢生物标志物的突破性研究。该研究旨在解决海龟早期生命阶段性别鉴定的难题，通过先进的代谢组学（metabolomics）技术，首次成功解码了蠵龟血浆中与性别相关的关键代谢物，为开发一种微创、可靠的早期性别诊断工具提供了坚实的科学依据。
一、研究背景与目的 蠵龟是全球分布的海龟物种，被列入《美国濒危物种法案》以及《国际自然保护联盟濒危物种红色名录》，其生存面临渔业误捕、气候变化、栖息地退化等多重威胁。对于这类温度依赖型性别决定（Temperature-dependent sex determination, TSD）的爬行动物，早期生命阶段缺乏明显的外部第二性征，使得性别鉴定极具挑战。传统的性别鉴定方法，如腹腔镜检查（coelioscopy），虽然是金标准，但具有侵入性、需要麻醉和专业操作，在野外或康复中心环境中存在风险且实施不便。而基于血浆常规生化分析或激素检测的方法，在稚龟和幼龟中往往灵敏度不足或需要大量样本。因此，开发一种高效、微创的早期性别鉴定技术对于理解爬行动物性别分化生理机制、评估气候变化对种群性别比例的影响以及制定有效的保护策略至关重要。
在此背景下，本研究的主要目标是：1）确定性别是否对蠵龟的血浆代谢组（plasma metabolome）产生影响；2）识别可用于蠵龟早期生命阶段（包括孵化后稚龟和幼龟）性别分类的潜在生物标志物（biomarkers）。研究假设，通过非靶向代谢组学分析（untargeted metabolomic analysis），能够发现与性别紧密相关、且在稚龟和幼龟阶段均稳定存在的特异性小分子代谢物，从而为性别鉴定提供新型、灵敏的血液生物标志物。
二、详细研究流程与方法 本研究设计严谨，包含样本收集、血浆生化分析、非靶向代谢组学分析、数据预处理、统计分析及生物标志物鉴定等多个步骤。
样本采集与动物伦理：研究共纳入100只蠵龟，分为两个生命阶段：孵化后稚龟（post-hatchling， n=50）和幼龟（juvenile， n=50）。其中每个阶段雌雄各半（n=25/性别）。稚龟样本来自瓦伦西亚海洋馆（Oceanogràfic）的圈养培育项目；幼龟样本则来自西班牙地中海地区被渔业误捕或接受康复治疗的野生个体。所有个体的性别均通过腹腔镜（laparoscopy）进行确认，此为最可靠的性别鉴定方法，作为后续代谢组学分析的“金标准”参照。所有采样和操作均遵循动物伦理规范并获得相应委员会批准（OCE-5-22）。
血浆常规生化分析：对所有100份血浆样本进行了一系列常规生化指标的检测，包括非酯化脂肪酸（non-esterified fatty acids, NEFA）、白蛋白（albumin）、总蛋白（total protein）、葡萄糖（glucose）、尿素（urea）、甘油三酯（triglycerides）、尿酸（uric acid）、胆固醇（cholesterol）、磷（phosphorus）和钙（calcium）。该步骤旨在评估传统血浆生化指标在区分雌雄方面的能力，并作为与代谢组学结果的对比。
非靶向液相色谱-质谱（LC-MS）代谢组学分析：从上述样本中随机选取48份（每个实验组：雌性稚龟、雄性稚龟、雌性幼龟、雄性幼龟各12份）进行深度代谢组学分析。样本前处理采用冰冷的乙腈（acetonitrile）沉淀蛋白，并使用包含稳定同位素标记物（如13C-甘氨胆酸）的混合内标。使用超高效液相色谱（UPLC）与四极杆飞行时间质谱（Q-TOF MS）联用系统进行分析，分别在正离子（ESI+）和负离子（ESI-）模式下采集数据。色谱分离采用HSS T3色谱柱，流动相为含甲酸的水和乙腈梯度洗脱。质谱采用数据非依赖采集（Data-independent acquisition, DIA）模式，能同时获取所有离子的碎片信息，有利于后续代谢物鉴定。在整个分析过程中，穿插进样由所有样本混合而成的质量控制样本（Quality control samples, QCS），用于监控系统稳定性和数据质量。
代谢组学数据预处理与代谢物鉴定：原始质谱数据使用MS-DIAL软件进行峰提取、对齐和缺失值填补。剔除空白样本中出现的峰，并进行主成分分析（PCA）以检查数据质量和排除离群值。随后，采用偏最小二乘法判别分析（Partial Least-Squares Discriminant Analysis, PLS-DA）来寻找能区分性别组的代谢物。通过变量重要性投影（Variable Importance in Projection, VIP）评分筛选关键差异代谢物。代谢物的鉴定通过查询人类代谢组数据库（Human Metabolome Database, HMDB）等公共数据库，比对精确质量和质谱碎片谱图来完成，文中列出的是暂定鉴定结果。
统计分析与生物标志物阈值确定：血浆生化数据使用广义线性模型（GLM）分析，考察性别、生命阶段及其交互作用的影响。代谢组学数据采用多种统计方法：PLS-DA模型用于区分组别并评估模型预测能力（通过R²和Q²值）；火山图用于可视化显著性差异代谢物；Wilcoxon秩和检验用于比较单个代谢物在组间的强度差异。对于有潜力的生物标志物（如C22H32O6和羧酸酯），研究不仅比较了其绝对强度，还计算了二者比值，并通过绘制小提琴图（violin plots）确定了能100%区分雌雄的浓度或比值阈值。
三、主要研究结果 1. 常规血浆生化分析未发现性别差异：对稚龟和幼龟两个阶段分别进行的分析显示，在所有检测的10项血浆生化指标中，雌雄个体之间均未发现统计学上的显著差异。这一结果证实了传统生化指标在鉴别早期生命阶段海龟性别方面的局限性，凸显了寻找更灵敏生物标志物的必要性。
代谢组学分析成功揭示显著的性别特异性图谱：与生化分析结果形成鲜明对比，非靶向代谢组学分析清晰地揭示了雌雄蠵龟血浆代谢谱的显著差异。PLS-DA得分图显示，无论在正离子还是负离子模式下，雌雄样本点均能很好地区分开，且重叠部分极少。这一模式在合并分析所有样本时（补充图1）以及在分别分析稚龟组（图3a,b）和幼龟组（图3f,g）时均稳定存在，表明性别对代谢组的影响是普遍且跨越不同生命阶段的。
鉴定出关键的性别差异代谢物：研究共鉴定出9种在雌雄间存在显著差异的代谢物（表3）。其中，一些代谢物作为潜在生物标志物尤其值得关注：
确定可用于性别分类的生物标志物及其阈值：研究重点验证了C22H32O6和羧酸酯作为生物标志物的潜力，并确定了区分性别的具体阈值：
模型验证：构建的PLS-DA模型表现出良好的拟合度和预测能力，平均R²为0.99，平均Q²为0.54，超过了通常认为具有良好预测性的阈值（Q² > 0.5），证实了代谢组学模型用于性别分类的可靠性。
四、结论与意义 本研究的主要结论是：1）蠵龟的血浆代谢组谱受到性别的显著影响；2）非靶向代谢组学是区分海龟性别的有力工具；3）特定的代谢物，尤其是C22H32O6、泛酸、羧酸酯和1-甲基组氨酸，可作为蠵龟早期生命阶段性别分类的潜在生物标志物。这些代谢物单独使用、组合使用或计算比值，均能实现可靠鉴别。
该研究的科学价值在于，首次系统性地揭示了爬行动物（特别是海龟）血浆代谢组的性别二态性，为理解海龟性别分化的生理和生化基础开辟了新视角。其应用价值巨大：所提出的代谢物生物标志物提供了一种微创（仅需少量血液）、灵敏、且可能适用于野外和康复场景的性别鉴定新方法，有望替代或补充传统的侵入性内窥镜检查。这对于大规模监测海龟种群性别比例、评估气候变化（如巢温升高导致雌性化）的生态影响、以及开展保护生物学研究具有重要实践意义。此外，该研究建立的分析流程和发现的代谢通路（如组氨酸和柠檬酸代谢）也为未来研究其他TSD爬行动物的性别分化机制提供了参考框架。
五、研究亮点 1. 研究对象的特殊性：针对具有重要保护意义且性别鉴定困难的蠵龟，聚焦于缺乏外部性征的早期生命阶段（稚龟和幼龟），研究需求迫切，应用导向明确。 2. 方法学的先进性与创新性：率先将非靶向代谢组学技术应用于海龟性别鉴定研究，通过高通量、无偏倚的筛选，发现了传统方法无法检测的性别差异信号。采用DIA质谱采集模式，增强了代谢物鉴定能力。 3. 严谨的实验设计：样本量充足（n=100），并严格以腹腔镜鉴定结果为金标准。设置了两个独立生命阶段进行内部验证，确保了发现结果的稳健性和普适性。 4. 明确的生物标志物与转化潜力：不仅鉴定出差异代谢物，更进一步确定了能够100%区分雌雄的量化阈值，使研究成果具有直接转化为实际诊断工具或试剂盒的潜力。提出的C22H32O6与羧酸酯的比值是一个简洁高效的判别指标。 5. 意外的环境暴露线索：发现雄性中更高的C7H14N2O7可能提示邻苯二甲酸酯暴露的性别差异，这为关注海龟所受环境污染（特别是内分泌干扰物）的影响提供了新的线索和思考方向。
这项由Marín-García等人完成的研究，通过精准的代谢组学策略，成功解码了蠵龟的“性别代谢密码”，为海龟保护生物学和爬行动物生理学研究贡献了一项兼具科学前沿性和实际应用价值的杰出成果。