研究报告：雌性小鼠对α-突触核蛋白病理传播具有抵抗性——一项基于M83转基因小鼠模型的纵向影像学研究
一、 研究团队与发表信息
本研究由一支国际研究团队合作完成。第一作者及通讯作者之一为Stephanie Tullo，其他主要作者包括Janice Sung Hyun Park、Daniel Gallino、Gabriel A. Devenyi、M. Mallar Chakravarty等。参与的机构主要来自加拿大的麦吉尔大学（McGill University）及其下属的道格拉斯研究中心（Douglas Research Center）、蒙特利尔神经学研究所（Montreal Neurological Institute），以及西安大略大学（University of Western Ontario）的罗巴茨研究所（Robarts Research Institute）。该项研究成果以题为《Female mice exhibit resistance to disease progression despite early pathology in a transgenic mouse model inoculated with alpha-synuclein fibrils》的论文形式，于2025年2月22日在线发表于《自然》旗下开放获取期刊《通讯-生物学》（Communications Biology）2025年第8卷。
二、 学术背景与研究目标
本研究的科学领域属于神经退行性疾病，特别是突触核蛋白病（Synucleinopathies）的发病机制研究。突触核蛋白病是一组以异常α-突触核蛋白（alpha-synuclein, α-syn）在脑内聚集为共同特征的疾病，包括帕金森病（Parkinson’s disease, PD）、路易体痴呆（Dementia with Lewy bodies, DLB）和多系统萎缩（Multiple system atrophy, MSA）等。大量临床证据表明，这些疾病在男性中的患病率、发病率和严重程度通常高于女性。然而，在临床前研究中，性别作为一个关键的生物学变量却常常被忽视，特别是在利用小鼠模型研究α-syn病理的“朊蛋白样”传播机制时。这种传播假说认为，错误折叠的α-syn可以在细胞间传递，引发连锁反应，导致神经变性和疾病进展。
先前的研究广泛使用了表达人类A53T突变α-syn的转基因小鼠模型（M83小鼠），通过向其纹状体注射人源α-syn预成型原纤维（human alpha-synuclein preformed fibrils, hu-PFF）来模拟病理的启动和播散。尽管该模型被广泛采用，但明确探索性别差异的研究却寥寥无几。本研究团队之前的一项横断面磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）研究虽然提示了性别差异的可能，但横断面设计可能无法捕捉疾病进展过程中的个体间变异和动态变化。
因此，本研究旨在系统性、纵向地探究在M83 hu-PFF小鼠模型中，性别对α-syn病理播散下游的神经变性轨迹、全脑萎缩模式以及疾病表型的影响。具体目标包括：1) 比较雄性和雌性小鼠在接种hu-PFF后，随时间推移的全脑体积变化轨迹；2) 在运动症状出现前后（90天和120天），解析性别特异的全脑结构协变萎缩模式；3) 评估性别对生存率、运动症状出现时间及运动行为学表现的影响；4) 探究未注射的M83小鼠中是否存在固有的、与性别相关的α-syn表达差异，以排除基线差异的干扰。
三、 详细研究流程与方法
本研究采用了严谨的纵向实验设计，整合了在体神经影像学、行为学测试和分子生物学技术。
1. 实验动物与分组： 研究对象为3-4月龄的M83半合子转基因小鼠（B6; C3H-Tg(SNCA)83Vle/J），该品系在朊蛋白启动子控制下表达带有人类A53T突变的一个拷贝人α-syn。小鼠按性别和注射物随机分为四组：雄性hu-PFF组、雄性磷酸盐缓冲液（PBS）对照组、雌性hu-PFF组、雌性PBS对照组。每组在每个时间点计划至少包含8只小鼠。基线时每组约有30只小鼠，随着时间点推进，部分小鼠被分流用于其他终末实验，以确保终点样本量。
2. 立体定位注射： 所有小鼠通过立体定位手术在右侧背侧纹状体注射2.5μl的hu-PFF（总蛋白12.5μg）或等体积的PBS。hu-PFF由蒙特利尔神经学研究所早期药物发现单元按照标准程序制备并表征，确保原纤维形态和尺寸符合要求。注射后，实验人员在数据采集和分析阶段对分组设盲。
3. 纵向时间点与数据采集流程： 实验设置了四个核心的纵向MRI和行为学评估时间点：注射前7天（-7 dpi，基线）、注射后30天（30 dpi，最早出现路易体样病理）、注射后90天（90 dpi，运动症状通常开始出现）、注射后120天（120 dpi，完全症状期，接近疾病终末期）。在每个时间点（±2天内），小鼠依次经历以下流程： * 体重测量。 * 在体结构MRI扫描： 使用7.0T布鲁克生物光谱仪采集高分辨率（100μm各向同性体素）T1加权图像。小鼠在扫描过程中使用异氟烷和右美托咪定复合麻醉。 * 运动行为学测试（扫描后24小时以上进行）： * 杆测试（Pole Test）： 评估运动敏捷性和精细运动，记录小鼠从垂直杆顶端下落到地面的时间（最长120秒）和成功率。 * 转棒测试（Rotarod）： 评估运动协调和平衡能力，记录小鼠在加速旋转的棒上行走的时间。 * 悬丝测试（Wire Hang Test）： 评估神经肌肉力量，记录小鼠倒挂在金属丝上直至掉落的时间（最长180秒）和成功率。
4. 影像数据处理与分析（核心技术方法）： * 预处理： MRI图像经过质量控制、去噪、偏置场校正，并线性配准到标准小鼠脑图谱（Dorr–Steadman–Ullman atlas）以生成粗略脑掩膜。 * 基于变形的形态测量学（Deformation-Based Morphometry, DBM）： 这是本研究用于量化纵向体积变化的核心分析方法。采用两级DBM流程：首先，将每个小鼠所有时间点的图像配准生成该个体的平均模板（第一级）；然后，将所有个体的模板配准生成一个最终的组水平模板（第二级）。通过计算每个时间点图像到组模板的变形场的雅可比行列式（Jacobian determinant），获得每个体素（voxel）的相对体积变化值（正值表示膨胀，负值表示萎缩）。这些体素级数据经过对数转换和高斯平滑处理，以符合统计假设。 * 统计分析： * 单变量分析（纵向轨迹）： 对每个体素的体积数据，使用线性混合效应模型（以个体为随机效应）分析注射分组、性别和时间点三因素的交互作用，以及各因素的主效应。统计图经过错误发现率（False Discovery Rate, FDR）校正。 * 多变量分析（全脑萎缩模式）： 使用正交投影非负矩阵分解（Orthogonal Projective Non-negative Matrix Factorization, OPNMF） 这一无监督机器学习方法。该方法将90 dpi和120 dpi时间点所有小鼠的体素级体积数据（z-scored后的绝对雅可比行列式）作为输入矩阵，分解为两个矩阵：一个是空间成分矩阵（反映哪些体素的体积变化具有协变模式），另一个是权重矩阵（反映每个小鼠在每个空间模式上的载荷）。通过稳定性分析和重建误差梯度确定最优成分数（K=6）。随后，利用广义线性模型检验每个空间成分的权重是否受到注射分组、性别或其交互作用的影响。此外，还计算了全组OPNMF得到的hu-PFF相关萎缩模式与分别从雄性或雌性数据中得到的性别特异模式之间的Dice相似性系数（Dice’s Kappa），以量化空间重叠程度。
5. 分子生物学分析： 为了排除M83小鼠本身存在性别相关的α-syn表达差异，研究对未注射的6-7月龄M83小鼠（4雄4雌）的皮层、纹状体和脑干组织进行了蛋白质印迹（Western Blotting）分析。检测了RIPA可溶性和不可溶性组分中的总α-syn、人源α-syn以及病理相关的磷酸化S129 α-syn（pS129）的水平。
6. 生存与表型数据分析： 使用Cox比例风险模型分析生存数据（以到达人道终点为标准）和运动症状出现时间。对体重和转棒测试数据使用线性混合效应模型。对于有严格时间截止（成功/失败判定）的杆测试和悬丝测试，同样使用Cox模型分析其成功率/失败率随时间的变化。
四、 主要研究结果
1. 疾病进展与运动表型的性别差异： * 生存率： hu-PFF注射显著降低了小鼠生存率，且存在显著的注射分组×性别交互作用。雄性hu-PFF小鼠在实验结束前（约120 dpi）达到人道终点的比例显著高于雌性，表明雄性对疾病进展的生理耐受性更差，病程更凶险。 * 运动症状出现时间： 尽管生存率有差异，但观察到的运动症状首次出现的时间在雄性和雌性hu-PFF小鼠之间没有显著差异。这提示性别差异主要体现在症状出现后的疾病进展速度上。 * 体重与行为学： hu-PFF小鼠体重呈现倒U型轨迹（90 dpi后下降），而PBS组持续增长，但无性别差异。在转棒测试中，未发现显著的组别×性别×时间交互作用。悬丝测试和杆测试在90 dpi和120 dpi均显示hu-PFF组表现显著差于PBS组（失败率更高、持续时间更短），但这两个测试也未显示出显著的性别差异。这表明传统的运动行为学测试可能对捕捉本模型中细微的性别差异不敏感。
2. 纵向神经解剖学变化轨迹： * 总体效应： 与PBS对照组相比，hu-PFF注射组小鼠随时间推移在多个脑区显示出显著的体积下降（萎缩），这些区域包括与注射部位（右侧纹状体）高度连接的对侧纹状体、双侧躯体运动皮层、导水管周围灰质，以及双侧丘脑等。 * 性别特异性轨迹： 关键的发现是存在显著的注射分组×性别×时间的三重交互作用。具体而言： * 雄性hu-PFF小鼠表现出最快、最急剧的神经变性速率。 萎缩加速的区域集中在注射部位（右纹状体）、同侧黑质、双侧运动皮层以及中脑网状核等关键运动相关区域。 * 雌性hu-PFF小鼠的体积下降轨迹相对平缓。 当分别分析雄性和雌性内部hu-PFF与PBS的差异时，雄性间的差异比雌性间的差异更为广泛和显著，尤其是在中脑和脑干区域。 * 直接比较雄性和雌性hu-PFF小鼠的轨迹也证实，雄性在多处脑区（如对侧纹状体）的萎缩速率显著高于雌性。
3. 全脑结构协变萎缩模式的性别差异（90 dpi，运动症状前期）： * 全组分析： OPNMF分析得到了6个空间协变成分。其中成分1的权重能显著区分hu-PFF组和PBS组（hu-PFF组权重更高），其空间模式涉及纹状体-苍白球-中脑通路、皮层和丘脑。有趣的是，该成分的权重还存在显著的主效应：所有雌性小鼠（无论注射PBS还是hu-PFF）的权重都显著高于所有雄性小鼠。这提示雌性大脑的结构协变模式本身可能与雄性不同，或对病理影响更敏感。 * 性别特异性分析： 为了深入探究，研究者分别对雄性和雌性数据进行了独立的OPNMF分析。 * 在雄性特异性分析中，成分5与hu-PFF注射相关。 * 在雌性特异性分析中，成分1与hu-PFF注射相关。 * 空间重叠比较： 计算全组hu-PFF相关成分（成分1）与性别特异成分的空间重叠度发现，雌性特异性成分与全组成分的重叠度（κ = 0.62）显著高于雄性特异性成分与全组成分的重叠度（κ = 0.46）。这表明，尽管雄性小鼠在局部区域的萎缩速率更快，但在90 dpi这个运动症状即将出现的时期，雌性hu-PFF小鼠已经表现出与全组模式高度一致的、更为广泛的空间萎缩网络。这种早期的广泛病理可能毒性较低，因为雌性小鼠并未因此更早出现运动症状或死亡。
4. 终末期（120 dpi）模式与分子基线： * 在120 dpi，OPNMF分析也发现了与hu-PFF注射相关的萎缩成分，但由于雄性hu-PFF小鼠存活数少，统计效力不足，未能进行有力的性别特异性分析，仅观察到趋势。 * 蛋白质印迹结果： 在未注射的M83小鼠中，未检测到雄性和雌性之间在总α-syn、人源α-syn或pS129 α-syn表达水平上的显著差异（无论在可溶还是不可溶组分中）。这排除了转基因表达基线差异是导致上述影像和行为表型性别差异的主要原因。
五、 研究结论与意义
本研究得出了一个核心且看似矛盾的结论：在M83 hu-PFF小鼠模型中，雌性小鼠虽然早在运动症状出现前（90 dpi）就已呈现出更广泛的全脑网络水平萎缩模式，但却对疾病进展表现出更强的抵抗力，具体表现为症状出现后更慢的局部萎缩速率和更高的生存率。而雄性小鼠则表现出更激进的局部萎缩轨迹和更差的生存结局。
这一发现具有重要的科学价值和应用启示： 1. 强调了性别作为生物学变量的极端重要性： 研究明确证明，在临床前突触核蛋白病模型中忽略性别因素，会严重限制我们对疾病机制全面、准确的理解。性别差异不仅影响表型，更影响神经变性在空间和时间上的动态过程。 2. 揭示了性别特异性的病理传播与耐受模式： 研究提示，雄性和雌性可能通过不同的机制应对α-syn病理。雌性大脑可能更早启动了一种涉及广泛网络的、或具补偿性的响应，这种响应在前期限制了毒性，但也造成了可检测的广泛萎缩；而雄性大脑的响应可能更具局灶性和破坏性，导致关键运动通路加速崩溃。这背后可能与性激素（如雌激素的神经保护作用、睾酮的促炎作用）、小胶质细胞/免疫反应、突触可塑性或代谢通路的性别差异有关。 3. 对疾病生物标志物和治疗的启示： 研究发现，广泛的脑萎缩在雌性中可能先于明显功能缺损出现。这提示，神经影像学生物标志物在男性和女性中可能具有不同的预测价值和时间窗。未来的治疗策略需要考虑到性别特异的病理机制和进展轨迹，开发个性化的干预方案。 4. 对临床前研究实践的呼吁： 研究强烈呼吁在临床前模型中常规且均衡地纳入雄性和雌性动物，并将激素周期等状态纳入考量，以提升动物模型对人类疾病（尤其是影响两性的疾病）的转化效度和预测价值。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的探讨
研究在讨论部分还指出了若干未来方向：1) 需要结合分子、细胞（如小胶质细胞、星形胶质细胞）和环路水平的研究，阐明驱动这些影像学性别差异的内在机制。2) 应评估非运动症状（如认知障碍），它们可能早于运动症状出现，且对性别差异更敏感，有助于更全面地表征疾病表型。3) 本研究中转棒测试对运动缺陷不敏感，提示需要开发或采用更精细的行为评估工具。4) 需在模型中引入激素调控（如卵巢切除、激素替代）以直接检验性激素的作用。这些思考为后续研究规划了清晰的路线图。