美国国家标准与技术研究院（NIST）的 Karen W. Phinney、Susan S.-C. Tai、Mary Bedner 等，联合美国疾病控制与预防中心（CDC）、美国国立卫生研究院膳食补充剂办公室（NIH-ODS）、加拿大卫生部等多个机构的研究人员，在 Analytical Chemistry 期刊上发表了题为《Development of an Improved Standard Reference Material for Vitamin D Metabolites in Human Serum》的研究论文。该研究报道了新一代标准参考物质 SRM 972a 的研制、定值方法及性能评价，旨在替代已售罄的 SRM 972，用于改善血清中维生素 D 代谢物检测的准确性与可比性。

维生素 D 在骨骼健康中具有重要作用，其缺乏可导致佝偻病和骨软化症。维生素 D 在体内首先在肝脏羟基化生成 25-羟基维生素 D2 和 25-羟基维生素 D3（25(OH)D2 和 25(OH)D3），循环中的 25(OH)D 被认为是反映维生素 D 暴露状态的最佳指标。由于 25(OH)D2 与 25(OH)D3 代谢途径相似，检测应同时涵盖两者。此外，25(OH)D3 的立体异构体 3-epi-25(OH)D3 在成人血清中几乎普遍存在，且与 25(OH)D3 具有相同的分子质量和极为相似的色谱保留行为及质谱碎裂模式，若不加以分离会导致 25(OH)D3 浓度被高估。25(OH)D 的定量检测方法主要包括色谱-质谱法和竞争性免疫分析法，但不同方法间以及同一方法随时间漂移的问题长期困扰着临床检测和人群研究。为应对标准化需求，NIST 于 2009 年推出了 SRM 972，但该物质四个水平中仅一个水平由未修饰人血清组成，其余水平分别添加了外源性 25(OH)D2、3-epi-25(OH)D3，或使用马血清稀释以降低浓度，这些设计缺陷使某些免疫分析法的检测结果出现偏差。因此，本研究研制了改进型标准物质 SRM 972a。

SRM 972a 由 Solomon Park Research Laboratories 按照 NIST 提供的规格制备，包含四个水平。其中水平 1 和水平 2 主要含天然 25(OH)D3，但水平 2 浓度更低，两者总 25(OH)D 浓度分别位于医学研究所（IOM）指南界定的“充足”范围和“不足”范围。水平 3 同时含天然 25(OH)D2 和 25(OH)D3，且浓度均高于 10 ng/mL，总 25(OH)D 浓度最高。水平 4 是在人血清中添加外源性 3-epi-25(OH)D3 制得，因为难以获得天然高浓度该代谢物的足够体积血清。

定值工作采用三种同位素稀释质谱方法，分别在 NIST 和 CDC 完成。NIST 的 LC-MS 方法使用大气压化学电离正离子模式，定量监测 m/z 383、386、389、395 和 398 等离子。该方法采用两种色谱柱进行分离：Ascentis Express F5 柱（150 mm × 4.6 mm，2.7 µm）在 15 ℃ 下以水:甲醇（26:74）等度洗脱；Zorbax SB-CN 柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm）在 45 ℃ 下以水:甲醇（33:67）等度洗脱。两种色谱条件均可分离 25(OH)D3 与 3-epi-25(OH)D3。NIST 的 LC-MS/MS 方法在 API 4000 系统上进行，采用 APCI 正离子模式和多反应监测，监测 m/z 401→383、407→389、404→386、413→395 和 416→398 等离子对。该方法既使用了 F5 柱，也使用了 CN 柱，其中较短的氰基柱（15 cm × 4.6 mm，3.5 µm）用于某些水平中 25(OH)D3 和 3-epi-25(OH)D3 的测定。CDC 的 LC-MS/MS 方法使用 Thermo Hypersil Gold 五氟苯基（PFP）柱在 28 ℃ 下以甲醇:水（69:31）等度洗脱，监测 25(OH)D3 的 m/z 383→365 和 383→105、25(OH)D3-d6 的 m/z 389→371、3-epi-25(OH)D3 的 m/z 383→365 和 383→105、3-epi-25(OH)D3-d3 的 m/z 386→368、25(OH)D2 的 m/z 395→377 和 395→209，以及 25(OH)D2-d3 的 m/z 398→380。校正曲线可溯源至 SRM 2972。

与 SRM 972 定值相比，SRM 972a 的方法学改进主要有三点。第一，所有三种方法均实现了 25(OH)D3 与 3-epi-25(OH)D3 的色谱分离。此前 CDC 的原始方法未分离二者，NIST 方法虽使用氰基柱成功分离但分析时间接近一小时且基线分离困难，新的 PFP 固定相方法在保持基线分离的同时显著缩短了分析时间。第二，NIST 方法中 3-epi-25(OH)D3 的定量改用了同位素标记的 3-epi-25(OH)D3-d3 作为内标，而在 SRM 972 研制时因无该标记物可用，只能使用 25(OH)D3-d6。第三，CDC 方法也升级为可同时测定 3-epi-25(OH)D3。不过，在 NIST LC-MS/MS 测量水平 1、2、3 的 3-epi-25(OH)D3 时，由于 3-epi-25(OH)D3-d3 内标附近存在小干扰，这些水平中该分析物仍使用 25(OH)D3-d6 定量。

三种方法的定值结果高度一致。例如 25(OH)D3 在水平 1 中，CDC LC-MS/MS 结果为 28.0 ng/g，NIST LC-MS 为 27.46 ng/g，NIST LC-MS/MS 为 28.88 ng/g；在水平 3 中三者分别为 19.4、18.68 和 19.39 ng/g。3-epi-25(OH)D3 在水平 4 中，三种方法结果分别为 25.3、25.33 和 25.68 ng/g。最终 SRM 972a 的认证值和参考值以 ng/mL 表示：25(OH)D3 在四个水平中分别为 28.8±1.1、18.1±0.4、19.8±0.4 和 29.4±0.9；25(OH)D2 为 0.54±0.06、0.81±0.06、13.3±0.3 和 0.55±0.10；3-epi-25(OH)D3 为 1.81±0.10、1.28±0.09、1.17±0.14 和 26.0±2.2。其中 3-epi-25(OH)D3 在水平 1、2、4 中为认证值，水平 3 因相对扩展不确定度大于 10% 而设为参考值；25(OH)D2 在水平 1 和 4 中因浓度接近定量限，设为参考值。与 SRM 972 相比，SRM 972a 的 25(OH)D2 水平 2、3、4 显著降低，3-epi-25(OH)D3 水平 4 也明显降低，反映了新物质以天然血清为主的设计理念。

在互通性评价方面，研究利用维生素 D 标准化计划（VDSP）框架，将 SRM 972a 四个水平与 50 份单供体患者样本同时交由参与实验室分析，并与 NIST 参考测量程序（RMP）结果比较。数据显示，在加拿大卫生部实验室使用 DiaSorin Liaison 自动免疫分析平台时，SRM 972a 四个水平的数据点均落在 95% 预测区间内，说明该物质与该免疫分析方法互通。在 CDC 的 LC-MS/MS 方法中，四个水平中三个水平的数据点完全落在较窄的预测区间内，水平 3 的数据点位于预测区间边缘，同样表明 SRM 972a 与该 LC-MS/MS 方法互通。

本研究的结论是，SRM 972a 在设计上明显优于前代 SRM 972，其三个水平由未修饰人血清组成，避免了外源添加物和非人血清基质带来的方法偏差问题。同时，定值方法全面实现了 25(OH)D3 与 3-epi-25(OH)D3 的色谱分离，提供了 3-epi-25(OH)D3 的认证值或参考值。该标准物质可作为临床和科研实验室检测准确性的基础，并在国际标准化工作中发挥关键锚点作用。其科学价值在于为维生素 D 代谢物检测提供了更高计量学质量的参考物质，应用价值则体现在支持临床诊断、人群营养调查和公共卫生政策制定。研究的亮点包括：首次在标准物质定值中同时采用三种均可分离 C3 差向异构体的同位素稀释质谱方法，显著降低了 3-epi-25(OH)D3 相关的测量偏差；通过互通性评价证明了 SRM 972a 对免疫分析法和 LC-MS/MS 法的广泛适用性；以及提供了 3-epi-25(OH)D3 的多水平认证值，这在以往标准物质中尚属首次。