本研究由Bingxin Wu、Xuechun Yu、Yanling Li、Lin An、Rongrong Zhang、Rong Zhang、Fan Zhang*、Zhongqiu Liu*和Caiyan Wang*共同完成，主要来自广州中医药大学国际中医药转化研究所和国家重点实验室，部分作者来自澳门科技大学中药质量研究国家重点实验室。该研究发表于《Advanced Science》期刊，发表时间为2025年。

学术背景

脓毒症（sepsis）是一种由感染引发的危及生命的全身炎症反应综合征，其病理特征包括免疫过度激活和细胞因子风暴失调，最终导致多器官功能障碍综合征、脓毒性休克甚至死亡。肝脏作为脓毒症进展过程中的关键器官，承担代谢稳态和异生物质解毒的双重生理功能，同时也是免疫调控的核心枢纽。然而，肝脏也是脓毒症病理生理学中最易受损的靶器官之一。脓毒症相关肝损伤不仅严重影响肝脏的解毒、代谢调节和生物合成能力，还会加剧全身炎症级联反应，从而显著增加患者死亡风险。目前针对脓毒症相关肝损伤的治疗策略主要依赖抗生素和支持性护理，但在逆转炎症反应和代谢失调方面效果有限。

近年来，研究发现丙酮酸激酶M2（Pyruvate Kinase M2, PKM2）在巨噬细胞代谢重编程和炎症反应调控中发挥核心作用。PKM2存在二聚体和四聚体两种形式，二聚体PKM2促进糖酵解中间产物的积累并激活炎症信号通路（如HIF-1α、NF-κB和STAT3），而四聚体PKM2则抑制糖酵解并增强线粒体氧化磷酸化，从而驱动巨噬细胞向抗炎M2表型极化。连翘酯苷E（Forsythoside E, FE）是传统中药连翘的主要活性成分之一，具有广谱抗炎和免疫调节特性，但其具体作用机制尚不清楚。因此，本研究旨在探索FE是否通过调控PKM2四聚化来改善脓毒症相关肝损伤，并阐明其分子机制。

研究流程

本研究采用多学科交叉方法，整合生物信息学、分子对接、蛋白质互作分析和动物模型等多种技术手段，系统探究了FE的作用机制。研究主要分为以下几个步骤：

1. 生物信息学分析：
   研究团队首先通过分析GEO数据库中的GSE57065、GSE166488和GSE254497数据集，发现PKM2在脓毒症患者和小鼠模型中的表达显著升高，且与巨噬细胞浸润和炎症信号通路（如TNF、NF-κB和IL-17通路）密切相关。KEGG富集分析显示，PKM2参与调控糖酵解/糖异生和HIF-1α信号通路。

2. 虚拟筛选与化合物鉴定：
   通过针对PKM2激动剂结合位点的高通量虚拟筛选（high-throughput virtual screening, HTVS），从超过30,000个小分子化合物中筛选出FE作为潜在的PKM2四聚化激活剂。分子对接结果显示，FE与PKM2的结合能较低（<-10 kcal/mol），提示其可能通过结合PKM2的K311位点促进四聚体形成。

3. FE与PKM2互作验证：
   研究团队设计了生物素标记和光亲和标记的FE探针，通过靶向垂钓技术（target fishing）结合质谱分析，证实FE直接与PKM2蛋白结合。表面等离子共振（SPR）实验显示FE与PKM2的结合亲和力为277 nM。此外，细胞热位移分析（CETSA）和药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）实验表明，FE显著增强PKM2蛋白的热稳定性。

4. PKM2 K311位点功能验证：
   通过构建PKM2 K311A突变体，研究发现FE无法有效促进突变体的四聚化。原子力显微镜（AFM）力谱分析和微量热泳动（MST）实验进一步证实，K311是FE结合PKM2的关键位点。动态光散射（DLS）和荧光共振能量转移（FRET）实验显示，FE能够促进PKM2野生型的聚集，但对K311A突变体无此作用。

5. 巨噬细胞代谢重编程研究：
   通过Seahorse代谢分析仪检测，研究发现FE显著抑制LPS诱导的巨噬细胞糖酵解（表现为细胞外酸化率ECAR降低），同时恢复线粒体氧化磷酸化功能（表现为耗氧率OCR升高）。免疫荧光和Mitotracker染色显示，FE能够修复LPS导致的线粒体膜电位下降和网络结构碎片化。

6. STAT3/NLRP3信号通路调控机制：
   免疫共沉淀（Co-IP）实验表明，FE抑制PKM2与STAT3的相互作用，从而减少STAT3磷酸化（p-STAT3）及其核转位。转录组测序和KEGG富集分析发现，FE显著抑制NLRP3炎症小体的转录激活。Western blot和qPCR结果显示，FE降低炎症相关蛋白（iNOS、TNF-α、IL-1β）和NLRP3的表达。

7. 动物模型验证：
   在盲肠结扎穿刺（CLP）诱导的脓毒症小鼠模型中，FE治疗显著改善肝损伤（表现为ALT和AST水平降低），促进巨噬细胞向M2表型极化（CD206表达升高，CD86表达降低），并抑制STAT3/NLRP3信号通路。通过骨髓注射AAV9载体构建巨噬细胞特异性过表达PKM2 WT或K311A的小鼠模型，进一步证实FE的作用依赖于PKM2 K311位点。

主要结果

1. FE促进PKM2四聚化：
   DSS交联实验和Western blot显示，FE剂量依赖性增加PKM2四聚体水平。在RAW264.7巨噬细胞中，FE处理组的PKM2四聚体比例较模型组提高约3倍（p < 0.001）。

2. 代谢重编程效应：
   Seahorse分析表明，FE将巨噬细胞的糖酵解能力从LPS组的180 mpH/min降至50 mpH/min（p < 0.01），同时将最大呼吸容量从150 pmol/min提升至300 pmol/min（p < 0.05）。

3. 抗炎作用：
   FE处理使M1标志物（TNF-α、IL-1β）的mRNA表达降低60%-70%，同时使M2标志物（IL-10、Arg1）表达升高2-3倍（p < 0.01）。在CLP模型中，FE治疗组肝脏NLRP3蛋白表达较模型组下降55%（p < 0.001）。

4. 肝保护效应：
   FE显著改善CLP小鼠的肝脏病理损伤，使肝细胞空泡化减少80%，血清ALT水平从500 U/L降至150 U/L（p < 0.001）。

结论与意义

本研究首次阐明FE通过靶向PKM2 K311位点促进其四聚化，进而调控巨噬细胞代谢重编程和STAT3/NLRP3信号通路，最终缓解脓毒症相关肝损伤的分子机制。这一发现具有以下重要价值： 1. 科学价值：揭示了PKM2四聚化在免疫代谢调控中的核心作用，提出了”代谢重塑-表观遗传”协同调控的新机制。 2. 应用价值：FE作为一种天然PKM2调节剂，为脓毒症治疗提供了新型候选药物。 3. 方法论贡献：建立了从传统中药活性成分到分子靶点的系统性研究方法，为中医药现代化研究提供范本。

研究亮点

1. 创新性发现：首次鉴定FE是PKM2的新型别构激活剂，并阐明其通过K311位点促进四聚化的结构基础。
2. 多学科技术整合：结合虚拟筛选、单细胞代谢分析和基因编辑动物模型，系统解析FE的作用机制。
3. 转化医学意义：FE在动物模型中展现出良好的安全性（无多器官毒性）和有效性，具有临床开发潜力。

其他有价值内容

研究还发现FE在体内以原型形式分布（通过LC-MS/MS检测血清和肝脏样本），且高剂量（80 mg/kg）下未显示毒性，为其后续临床应用提供了药代动力学依据。此外，作者提出未来可通过设计FE前药或纳米递送系统进一步提高其生物利用度。