本文属于类型a，为单一原创研究论文的学术报告。

本研究由美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention, CDC）的Huiping Chen、Leslie F. McCoy、Rosemary L. Schleicher和Christine M. Pfeiffer完成，其中Rosemary L. Schleicher为通讯作者。论文发表于*Clinica Chimica Acta*期刊，2008年1月24日在线发表，刊载于第391卷第6至12页。

研究的学术背景围绕维生素D状态评估的实验室检测方法展开。维生素D包括植物来源的麦角钙化醇（ergocalciferol，维生素D2）和皮肤经紫外线B照射后合成的胆钙化醇（cholecalciferol，维生素D3），二者在肝脏代谢为25-羟基形式（25-hydroxyvitamin D，25OHD），这是体内维生素D的主要循环形式，也是评价维生素D状态的最佳指标。维生素D缺乏可导致儿童佝偻病、成人继发性甲状旁腺功能亢进、骨丢失与骨质疏松，并与癌症风险等多种整体健康结局相关。临床实验室广泛使用DiaSorin 25OHD放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA），其采用乙腈提取后以125I标记的25OHD和可等量识别25OHD2与25OHD3的抗体进行竞争性分析。近年来虽有若干液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）方法发表，但本研究旨在基于Vogeser、Taylor和Singh等的方法，建立一种高通量、样本前处理简单、可同时定量血清25OHD3和25OHD2的常规色谱-质谱方法，并与DiaSorin RIA进行系统的方法学比较。

在具体工作流程方面，研究可分为方法建立与验证、方法比较与统计分析两大阶段。在试剂与标准品方面，标准品25OHD3和25OHD2分别溶于乙醇制备工作液，通过264 nm处紫外分光光度法以摩尔消光系数18200 M⁻¹cm⁻¹标定浓度，并将等体积的25OHD3与25OHD2工作液混合，配制成50至1000 ng/ml的混合标准溶液。校准溶液以4%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）为基质，将混合标准溶液按1∶9稀释，得到5至100 ng/ml的系列浓度。内标为26,27-六氘代-25-羟基维生素D3（[2H6]-25OHD3），工作浓度为11 ng/ml。质控样本来自匿名献血者的空腹血清混合池，分为低、中、高三个浓度水平。

样本前处理流程为：取200 µl血清、校准品或质控品置于硼硅酸盐玻璃培养管中，加入50 µl内标溶液并涡旋混匀，再加入250 µl乙腈沉淀蛋白，涡旋30秒，室温平衡10分钟，1200×g离心20分钟，取上清液进样。在线固相萃取采用Oasis HLB萃取柱，以水/甲醇（70/30，v/v）为萃取和柱清洗液，以乙腈/甲醇（50/50，v/v）为清洗液。分析柱为Supelcosil LC-18-DB（30×3 mm，3 μm粒径），由外置泵以0.5 ml/min输送乙醇/水（83/17，v/v）进行等度洗脱。检测采用大气压化学电离（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）正离子模式和多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）。25OHD3的离子对为m/z 401.4→383.4，25OHD2为m/z 413.4→395.4，内标[2H6]-25OHD3为m/z 407.7→389.7。保留时间约为3.8至4.0分钟，总运行时间为7分钟，每天可检测约80份患者样本，而本实验室RIA法通常每日检测55份重复样本。

在方法验证中，25OHD3和25OHD2的校准曲线在5–100 ng/ml范围内线性良好，10天内25OHD3曲线斜率为0.098、截距为−0.39、相关系数为0.99；25OHD2曲线斜率为0.044、截距为−0.13、相关系数为0.99。校准基质比较实验显示，以85%甲醇制备的校准品中25OHD3信号强度比血清基质低40%，比4%白蛋白基质低15%，且最低浓度校准品在85%甲醇中无法检出；内标虽可补偿基质差异，但本研究最终选择4%白蛋白PBS作为背景干净的校准基质。方法的不精密度方面，低、中、高质控品中25OHD3的批内变异系数（coefficient of variation，CV）分别为6.2%、4.0%和2.9%，批间CV分别为11.0%、9.4%和6.3%；25OHD2的批内CV分别为8.7%、7.1%和2.7%，批间CV分别为16.3%、15.3%和15.1%。加标回收实验中25OHD3平均回收率为99%，25OHD2为95%。25OHD3的检出限为0.49 ng/ml，定量限为1.65 ng/ml；25OHD2的检出限为1.86 ng/ml，定量限为6.21 ng/ml。此外，研究考察了非特异性吸附与容器干扰问题。结果显示某公司生产的聚丙烯离心管在m/z 401/383处产生正干扰，使25OHD3测量值从41.2 ng/ml增加到73.7 ng/ml；而玻璃培养管、硅烷化琥珀色瓶和另一品牌聚丙烯管未观察到显著干扰，也未发现显著非特异性吸附损失。稳定性实验表明，血清中25OHD3和25OHD2至少可耐受4次冻融循环；在室温日光下放置至少6小时无显著降解；血清提取物在4°C保存一周无显著浓度变化。

方法比较研究采用美国国家健康与营养调查（National Health and Nutrition Examination Survey，NHANES）中的554份血清样本，按RIA结果选取低、中、高浓度均衡分布，其中92%来自2005–2006年调查期，8%来自2003–2004年调查期。三对差异超过平均值±4倍标准差的样本被剔除，最终纳入551份。LC-MS/MS测得总25OHD（25OHD2与25OHD3之和）均值为31.0 ng/ml，中位数为30.0 ng/ml，范围为4.9–79.9 ng/ml；RIA均值为28.8 ng/ml，中位数为27 ng/ml，范围为3–77 ng/ml。方法差异具有浓度依赖性：在低浓度区LC-MS/MS结果高于RIA，在高浓度区则低于RIA。总体上，LC-MS/MS结果比RIA平均高13%（95%置信区间11–15%）。Bland-Altman分析显示相对差异的95%一致性界限为−23%至+65%。经平方根转换后线性回归方程为√LC-MS/MS = 0.8621×√RIA + 0.9542，相关系数r为0.96，斜率95%置信区间为0.8403至0.8840，截距为0.8368至1.0716。551份样本中有38份检出25OHD2，其占总25OHD比例为5%至92%；该亚组中LC-MS/MS结果比RIA平均高17%。仅含25OHD3的513份样本中，LC-MS/MS结果比RIA平均高12%，回归方程为√LC-MS/MS = 0.8666×√RIA + 0.9181，r为0.96。在DEQAS外部质量评价的4次活动中，本方法与其他实验室LC-MS或LC-MS/MS方法结果高度相关，Pearson相关系数为0.98，平均低1.57 ng/ml。

研究结论认为，所建立的LC-MS/MS方法简单、高通量、灵敏、准确且精密，适用于血清25OHD2和25OHD3的常规临床检测。方法比较显示该法与DiaSorin RIA一致性良好，并提供了含仅25OHD3或同时含25OHD2样本的换算方程。研究价值体现在：为维生素D状态评估提供了一种可同时区分并定量25OHD2和25OHD3的候选参考方法；揭示了校准基质对质谱响应的重要影响，建议使用4%白蛋白PBS作为背景干净基质；发现特定聚丙烯离心管可产生正干扰，提醒临床质谱检测中耗材选择的重要性；系统评估了分析物的冻融、光照和提取物稳定性；并通过大样本方法比较为NHANES 2005–2006年RIA数据向LC-MS/MS等效值转换提供了依据。该研究还强调标准参考物质的缺乏是不同实验室间变异的重要原因，并指出美国国家标准与技术研究院（NIST）正在制备25OHD参考物质。