本研究由来自英国多所高校的Yoana D. Petrova、Jinlian Zhao、Gordon Webster、Alex J. Mullins、Katherine Williams、Amal S. Alswat、Gregory L. Challis、Andy M. Bailey以及Eshwar Mahenthiralingam等学者合作完成。主要研究机构包括卡迪夫大学（Cardiff University）、华威大学（University of Warwick）和布里斯托大学（University of Bristol）等。该研究于2022年发表在期刊“Microbial Biotechnology”上。

该研究的学术背景聚焦于微生物生物技术领域，具体涉及合成生物学和农业生物防治。伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）能够产生多种具有抗菌活性的次级代谢产物，包括多烯化合物，因此具有作为生物防治剂的巨大潜力。然而，由于其部分物种是人类条件致病菌，特别是在囊性纤维化患者中可引起感染，导致美国环境保护署（EPA）暂停了基于伯克霍尔德氏菌的生物农药产品，极大地限制了其在农业上的应用。近年来，基于基因组学分类，从伯克霍尔德氏菌属中拆分出了副伯克霍尔德氏菌属（Paraburkholderia）。该属细菌多为环境菌株，一些种类具有植物促生和保护作用，并且许多菌株在37°C（人类体温）下生长受限，这暗示其可能具有更低的人体致病风险。基于此背景，本研究旨在开发一种策略：将伯克霍尔德氏菌中编码具有生物防治价值的多烯化合物（如cepacin和caryoynencin）的生物合成基因簇（Biosynthetic Gene Cluster， BGC），异源表达于非致病性或低致病风险的副伯克霍尔德氏菌宿主中，从而构建出安全、高效的工程菌株，为开发新型生物农药铺平道路。研究目标包括：构建可在酵母、大肠杆菌和伯克霍尔德菌/副伯克霍尔德菌之间穿梭的质粒载体；利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的体内同源重组能力克隆大的多烯生物合成基因簇；评估这些基因簇在异源宿主中的表达和生物活性；以及筛选更多在37°C下生长受限的副伯克霍尔德菌株作为潜在的异源表达平台。

研究的工作流程包含多个详细步骤，涉及分子克隆、代谢物检测和生物活性评估等多个方面。具体流程如下： 首先，研究团队对现有的pMLBAD质粒进行了酵母适应性改造。pMLBAD是一个可在大肠杆菌和伯克霍尔德菌之间穿梭的阿拉伯糖诱导型表达载体。为了利用酵母高效的体内同源重组克隆大片段基因簇，研究人员从pE-YA质粒中扩增了包含酵母2μ复制起点和URA3选择标记的片段，通过酵母转化和同源重组，将其整合到线性化的pMLBAD骨架中，成功构建了名为pMLBAD_yeast的三宿主（大肠杆菌-伯克霍尔德菌-酿酒酵母）穿梭载体。这是本研究方法学上的一个关键创新点。 其次，为了验证改造后载体的表达功能，研究者克隆了一个报告基因簇。他们将来自发光杆菌（Photorhabdus luminescens）的无启动子luxCDABE荧光素酶操纵子，通过酵母同源重组（分成两个重叠片段）克隆到pMLBAD_yeast的阿拉伯糖诱导型启动子pBAD下游，构建了pMLBAD_yeast_luxCDABE质粒，并构建了反向对照质粒。随后，他们将这两个质粒分别转入大肠杆菌、两种伯克霍尔德菌（Burkholderia ambifaria和B. vietnamiensis）以及一种副伯克霍尔德菌（Paraburkholderia phytofirmans PSJN）中。通过在不同浓度L-阿拉伯糖或D-葡萄糖的培养基中培养这些工程菌，并测量其发光强度和菌体密度，他们系统评估了pBAD启动子在这些不同宿主中的诱导和抑制特性。实验发现，在0.05%的阿拉伯糖浓度下，所有测试菌株（除B. ambifaria BCC0191外）的启动子均被有效诱导，但更高的阿拉伯糖浓度并未显著增强发光。此外，与在大肠杆菌中不同，D-葡萄糖并未在伯克霍尔德菌中表现出明显的pBAD启动子抑制作用，这表明碳源代谢调控在不同菌属间存在差异。 第三，研究进入了核心阶段——多烯生物合成基因簇的克隆与异源表达。研究人员选择了两个已表征的多烯化合物基因簇：来自B. ambifaria BCC0191的约13 kb的cepacin A基因簇，以及来自B. gladioli BCC1697的约11 kb的caryoynencin基因簇。利用酵母同源重组技术，将每个基因簇通过PCR扩增成三个重叠的片段，克隆到pMLBAD_yeast的pBAD启动子下游，分别构建了pMLBAD_yeast_pBADcep和pMLBAD_yeast_pBADcay质粒。随后，通过接合转移将这些质粒导入不同的异源宿主，包括B. ambifaria BCC1105（另一种伯克霍尔德菌）和P. phytofirmans PSJN（副伯克霍尔德菌）。为了评估表达是否成功，研究者采用了高分辨液质联用技术（LC-MS）来分析代谢物提取物。结果表明，携带cepacin或caryoynencin基因簇的工程化P. phytofirmans PSJN和B. ambifaria BCC1105均能检测到对应的多烯化合物，而空载体对照则没有，这直接证明了异源表达的成功。 第四，为了探索更接近天然状态的表达调控，并避免使用外源诱导剂（阿拉伯糖），研究者进一步利用酵母同源重组技术，将质粒上的pBAD启动子替换为各个多烯基因簇自身的天然启动子。他们构建了带有卡那霉素抗性筛选标记和天然启动子的片段，通过同源重组替换掉原有质粒上的araC-pBAD区域，成功构建了由天然启动子驱动的表达载体。 第五，研究者对多烯化合物的产量进行了半定量分析，并评估了工程菌的生物活性。他们比较了天然生产菌、异源工程菌在不同培养基（包括成分明确的BSM-G培养基和模拟豌豆根系分泌物的生物模拟培养基PEM）上生产多烯的能力。通过高效液相色谱（HPLC）分析，并归一化于菌体生物量，他们发现异源宿主的产量受培养基影响很大。例如，在BSM-G培养基上，异源宿主生产的caryoynencin量低于天然生产者，但在PEM培养基上，产量则相近。更为重要的是，他们通过经典的覆盖法（overlay assay）和接触拮抗法（contact antagonism assay）系统评估了工程菌的抗菌活性。测试的靶标微生物包括多种植物病原细菌（如金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus）、真菌（如Zymoseptoria tritici, Corynespora cassiicola）和卵菌（如Globisporangium ultimum）。结果显示，携带空载体的P. phytofirmans PSJN没有抗菌活性。而携带cepacin或caryoynencin基因簇的工程化P. phytofirmans PSJN则获得了新的、广泛的抗菌活性，其活性谱与天然生产者相似，尽管在某些情况下抑制强度略低。特别是由pBAD启动子驱动cepacin表达的工程菌，其生物活性与天然生产者相当。这些生物活性数据与LC-MS检测到的代谢物产生情况相互印证，强有力地证明了异源表达不仅产生了化合物，而且这些化合物具有预期的生物功能。 第六，为了寻找更多安全的异源表达宿主，研究者对43株副伯克霍尔德菌（涵盖27个物种）进行了生长温度偏好性筛选。他们在30°C和37°C下测量这些菌株的生长曲线，通过分析生长曲线下面积（AUC）和最大承载量（K）等参数，鉴定出13株在37°C下生长显著受限的菌株。其中，P. bannensis BCC1915在37°C下几乎不生长。研究者从这些菌株中挑选了3株（P. bannensis BCC1915， P. tropica BCC1950和Paraburkholderia sp. BCC1909）进行后续实验。结果表明，这3株菌都能成功接合含有caryoynencin基因簇的质粒，并且LC-MS证实它们能够产生caryoynencin。生物活性测试也显示，这些工程菌获得了针对金黄色葡萄球菌和卵菌Gl. ultimum的抑制能力。这部分工作拓展了可用作安全生物技术平台的菌株资源库。

研究的主要结果在各个流程环节均有清晰体现。在载体构建与验证环节，成功获得了pMLBAD_yeast穿梭载体，并证实pBAD启动子在目标宿主中基本可控，为后续工作奠定了基础。在多烯基因簇克隆与表达环节，LC-MS数据是核心结果，直接证实了异源宿主能合成目标多烯化合物。在生物活性评估环节，覆盖法和接触拮抗法产生的抑菌圈直径和菌丝生长抑制百分比等量化数据，与代谢物检测结果逻辑对应，共同证明工程菌获得了预期的抗菌功能。这些结果一环扣一环：载体构建的成功使得基因克隆成为可能；克隆和代谢物检测的成功是生物活性产生的前提；而生物活性的证实则是构建生物防治菌株的应用价值体现。在宿主筛选环节，生长曲线数据和后续工程化成功的案例，共同支持了“生长温度受限的副伯克霍尔德菌可作为安全异源宿主”这一结论。

本研究的结论是，成功开发并验证了一种利用副伯克霍尔德氏菌作为异源宿主表达伯克霍尔德氏菌多烯生物合成基因簇的策略。该策略包含一个高效的三宿主克隆系统和多个经过验证的、在37°C下生长受限的安全表达宿主。研究不仅证明了概念可行性，即工程化的副伯克霍尔德菌能够产生具有广谱抗植物病原菌活性的多烯化合物，还筛选出了一批具有应用潜力的新宿主菌株。这项工作的科学价值在于，它提供了一种将具有生物防治潜力但伴随安全风险的微生物代谢途径“移植”到更安全宿主中的合成生物学方法学范例。其应用价值则直接指向农业领域：为开发下一代基于工程微生物的、环境友好且对人畜安全性更高的生物农药产品提供了关键的技术路径和菌株资源。同时，研究也指出了未来需要努力的方向，例如提高质粒在无抗生素选择压力下的稳定性，以及更全面地评估工程菌株在真实农田环境中的定殖能力和安全性。

本研究的亮点突出。首先，在方法学上，创造性地改造并应用了基于酵母同源重组的三宿主穿梭载体系统，极大地便利了大片段细菌生物合成基因簇的克隆和操作。其次，在研究思路上，巧妙地将“代谢途径异源表达”与“宿主安全性筛选”相结合，瞄准了农业生物防治中的实际痛点（致病风险），使研究具有鲜明的应用导向性。第三，在研究成果上，不仅成功实现了两种重要多烯化合物的异源表达和功能验证，还系统性地筛选并验证了多个新型安全表达宿主，极大地拓展了该技术平台的适用范围。最后，研究数据详实，从分子克隆到代谢物检测，再到多种病原微生物的生物活性评估，形成了完整的证据链条，结论可靠。

其他有价值的内容还包括对质粒拷贝数和稳定性的初步探讨，发现pMLBAD_yeast在不同宿主中拷贝数有差异（2-19个/细胞），且在无抗生素压力下丢失较快，这为未来构建更稳定的整合型载体提供了参考。此外，研究还发现将caryoynencin基因簇转入天然的cepacin生产者中，可以同时生产两种多烯且无明显相互干扰，这为构建能产生多种活性化合物的“超级”工程菌打开了思路。讨论部分也客观指出了尽管副伯克霍尔德菌在37°C下生长受限，但其潜在的致病性仍需通过更复杂的感染模型来进一步评估，体现了研究的严谨性。