关于Epothilone B通过Tau稳定微管以保护视网膜神经节细胞并促进轴突再生的研究报告
本研究由来自中国吉林大学第二医院眼科（Department of Ophthalmology, Second Norman Bethune Hospital of Jilin University）的Yang Liang, Jing Chi, Ying-Jian Sun, Yun-Zhi Li, Yu-Lin Li & Guang-Yu Li团队完成。该研究于2026年发表在期刊 Cell Communication and Signaling 上。
一、 学术背景 本研究聚焦于神经科学领域，具体关注中枢神经系统损伤修复，尤其是视神经损伤后的轴突再生难题。轴突是神经元的长距离信息传递通道，其内部由微管（Microtubules）构成的细胞骨架不仅提供结构支撑，更是物质运输的“轨道”。微管的稳定性对于轴突的完整性、物质运输以及损伤后的再生至关重要。Tau蛋白是一种微管相关蛋白，其主要功能是结合并稳定微管，促进微管成束，从而维持运输轨道的完整性。然而，在神经损伤或神经退行性疾病中，Tau蛋白会发生异常的过度磷酸化，导致其从微管上解离，进而引发微管解聚、轴突运输中断和最终的神经元变性死亡。这种机制在阿尔茨海默病和青光眼等疾病中已被观察到。因此，探索如何通过调节Tau蛋白功能来稳定微管，成为促进轴突修复和再生的一个有潜力的策略。
本研究旨在探究小分子药物埃博霉素B（Epothilone B, EpoB）是否能够通过作用于Tau蛋白来稳定微管，从而在视神经损伤模型中发挥保护视网膜神经节细胞（Retinal Ganglion Cells, RGCs）和促进轴突再生的作用。研究目标包括：1）通过计算模拟验证EpoB对Tau-微管蛋白复合物结合的增强作用；2）在动物模型中验证EpoB抑制Tau异常磷酸化、稳定微管的效果；3）评估EpoB对轴突结构保护、轴突运输功能改善以及RGC存活的影响；4）探索EpoB与其他促再生手段（如PTEN敲低）联合治疗的协同效应。
二、 详细工作流程 本研究是一个综合性研究，结合了计算生物学、分子生物学、组织形态学、电生理学和行为学等多个层面的实验，主要流程如下：
1. 计算模拟与机制预测： * 研究对象与方法： 首先，研究团队基于人源的微管蛋白-Tau（Tub-Tau）复合物晶体结构，通过同源建模构建了小鼠的Tub-Tau复合物模型。从PubChem数据库获取了包括紫杉醇（Taxol）、多西他赛（Docetaxel）、Peloruside A、Discodermolide和埃博霉素B（EpoB）在内的五种微管稳定剂的三维结构。 * 实验步骤： 使用AutoDock Vina软件进行分子对接模拟，计算这些分子与微管蛋白二聚体的结合自由能。随后，针对结合能表现优异的EpoB，进行了更深入的分子动力学模拟。他们构建了包含与不包含EpoB分子的Tub-Tau复合物系统，使用AMBER力场进行了长达100纳秒的模拟。 * 数据分析： 分析模拟轨迹，计算了复合物的均方根偏差（RMSD）、均方根涨落（RMSF）和回转半径（Rg），以评估复合物的结构稳定性。更重要的是，采用MM/GBSA方法计算了复合物的结合自由能（ΔGbind），并分析了EpoB与蛋白质之间的相互作用（氢键、疏水作用）。
2. 动物模型建立与药物处理： * 研究对象： 使用了总计150只成年C57BL/6J小鼠（6-8周龄）。所有动物操作均遵循伦理规范。 * 损伤模型： 建立了两种RGC轴突损伤模型：① 视网膜缺血再灌注（Ischemia/Reperfusion, I/R）损伤模型：通过升高眼内压（90-100 mmHg）45分钟诱导视网膜缺血，然后恢复灌注。② 视神经挤压（Optic Nerve Crush, ONC）损伤模型：在眼球后方1mm处用镊子挤压视神经15秒。 * 药物处理： EpoB溶解后通过腹腔注射给药。在I/R模型中，于损伤后第0、3、7天给药；在ONC模型中，于损伤后第0、3、7、14天给药。剂量为0.5 mg/kg。对照组注射等量溶剂。
3. 分子与生化水平验证： * 实验方法： 在损伤后不同时间点（如第1、4、7、14、28天）收取视网膜和视神经组织。 * 蛋白质印迹（Western Blot）： 检测总Tau蛋白以及其在Thr231、Ser262、Ser396位点的磷酸化水平，以及乙酰化α-微管蛋白（Ac-tubulin，微管稳定的标志物）的表达变化。 * 免疫共沉淀（Co-IP）： 使用抗Tuj1（神经元特异性微管蛋白标记）或抗Tau抗体，从视神经组织裂解液中富集与微管蛋白或Tau相互作用的蛋白复合物，然后通过Western Blot验证Tau与微管蛋白的结合强度。
4. 形态学与结构分析： * 轴突标记与成像： 通过玻璃体腔内注射携带mCherry荧光蛋白的腺相关病毒（AAV-mCherry）或Alexa Fluor 488标记的霍乱毒素B亚单位（CTB）对RGC轴突进行顺行标记。通过立体定位注射氟金（Fluoro-Gold, FG）到上丘（Superior Colliculus, SC）进行逆行标记。 * 评估指标： 使用共聚焦显微镜成像，量化视神经中轴突回缩球（Retraction bulbs，轴突退变的标志）的密度、完整轴突（Tuj1阳性）的数量，以及CTB在视觉中枢（外侧膝状体LGN和上丘SC）的荧光强度（反映顺行运输效率），以及FG标记的RGCs比例（反映逆行运输效率和RGC存活）。 * 透射电子显微镜（TEM）： 对视神经样本进行超薄切片和染色，在纳米分辨率下观察轴突内部微管的排列状态、线粒体形态以及回缩球的超微结构。
5. 功能学评估： * 视网膜电图（Electroretinogram, ERG）： 记录暗适应下的正性视锐峰（PSTR）和明适应下的负性后电位（PhNR），这两个波形主要反映RGC的功能活性，用于评估EpoB对RGC功能的保护作用。
6. 联合治疗探索： * 实验设计： 在ONC模型中，引入PTEN敲低（一种已知能显著促进中枢神经轴突再生的手段）作为对照和联合治疗组。在ONC损伤前14天，通过玻璃体腔注射AAV-shPTEN病毒实现PTEN敲低。 * 评估： 比较单独EpoB治疗、单独PTEN敲低以及两者联合治疗对轴突再生数量、长度以及RGC存活率的影响。
7. 数据分析： * 所有定量数据均以均值±标准误表示。使用GraphPad Prism 9.0进行统计分析。多组比较采用单因素方差分析（ANOVA）及Bonferroni事后检验，两组间比较采用非配对双尾Student’s t检验。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。
三、 主要研究结果 1. 计算模拟结果： 分子对接显示，在五种微管稳定剂中，紫杉醇结合自由能最低，EpoB次之。考虑到EpoB具有优异的血视网膜屏障穿透能力，研究重点分析了EpoB。分子动力学模拟表明，EpoB能够迁移至Tub-Tau复合物的结合口袋，通过氢键和疏水作用同时与微管蛋白和Tau蛋白相互作用，从而“桥接”二者。加入EpoB后，Tub-Tau复合物的RMSD显著降低（结构更稳定），Tau蛋白的RMSF降低（波动性减小），结合自由能（ΔGbind）进一步降低了约15.8 kcal/mol。这表明EpoB能主动增强Tau与微管蛋白的亲和力与复合物整体稳定性。
2. 对Tau磷酸化及Tub-Tau结合的影响： 在I/R和ONC两种损伤模型中，损伤均导致视神经和视网膜中总Tau蛋白水平升高，并且在Thr231、Ser262、Ser396位点的异常磷酸化显著增加。EpoB治疗能显著抑制这种异常磷酸化。Co-IP实验直接证实，损伤后Tau与微管蛋白（Tuj1）的结合减弱，而EpoB治疗能显著增强两者的结合。这验证了计算模拟的预测，即EpoB在体内通过抑制Tau异常磷酸化来稳定Tau与微管的结合。
3. 对轴突结构保护及微管稳定的作用： * 减少回缩球形成： AAV-mCherry标记显示，I/R和ONC损伤后，视神经轴突上形成大量回缩球。EpoB治疗显著降低了回缩球的密度（例如，I/R后第7天，远端回缩球数量从650个减少到283.5个）。 * 维持微管有序结构： Western Blot显示EpoB能维持损伤视神经中Ac-tubulin的高表达。TEM结果提供了关键证据：在损伤对照组，回缩球内的微管解聚、排列紊乱；而在EpoB治疗组，许多回缩球内部保留了排列有序的微管束，其结构与PTEN敲低后促进再生形成的生长锥（Growth cone）内的微管排列相似。
4. 改善轴突运输功能： * 顺行运输： CTB顺行标记显示，损伤后到达上丘（SC）和外侧膝状体（LGN）的荧光信号大幅减弱。EpoB治疗显著增强了这些脑区的CTB荧光强度，表明轴突的顺行运输功能得到改善，长距离轴突投射得以维持。 * 逆行运输： FG逆行标记显示，损伤后能被FG标记的存活RGCs比例下降。EpoB治疗提高了FG阳性RGCs的比例和荧光强度，表明逆行运输功能也得到改善。
5. 保护RGC存活与功能： * 数量保护： 通过RBPMS（RGC标志物）免疫荧光计数，发现I/R损伤导致RGC大量死亡。EpoB治疗显著提高了损伤后的RGC存活率（例如，I/R后第7天，存活率从31.82%提升至67.49%）。 * 功能保护： ERG检测显示，I/R损伤后反映RGC功能的PSTR和PhNR波幅显著降低。EpoB治疗能显著减轻这种波幅下降，表明RGC的神经电生理功能得到保护。
6. 联合治疗促进轴突再生： 在ONC模型中，单独EpoB治疗或单独PTEN敲低均能诱导一定数量的轴突再生（CTB阳性轴突越过损伤点）。然而，两者联合治疗产生了显著的叠加改善效应：再生轴突的数量和长度均显著超过任一单独治疗组。同时，联合治疗也带来了最高的RGC存活率（达到60.11%）。这表明，微管稳定（EpoB）与内在生长能力激活（PTEN敲低）是互补的促再生策略。
四、 研究结论 本研究揭示了一种新的机制：小分子药物埃博霉素B（EpoB）能够通过结合并稳定Tau蛋白与微管蛋白的界面，抑制损伤诱导的Tau异常磷酸化，从而增强微管的稳定性。在视神经损伤模型中，这种微管稳定作用带来了多方面的益处：1）减少轴突退变的形态学标志——回缩球的形成；2）在回缩球内维持有序的微管结构，为轴突再生创造了有利的细胞骨架基础；3）保护轴突结构完整性，改善双向轴突物质运输；4）最终保护了视网膜神经节细胞（RGCs）的存活和功能。更重要的是，EpoB与PTEN敲低联合应用能协同促进轴突再生。因此，本研究提出了一种通过药理性稳定微管来促进轴突修复和再生的新策略，为治疗青光眼、视神经损伤等与视神经病变相关的疾病提供了新的视角和潜在的治疗靶点。
五、 研究亮点 1. 机制新颖性： 首次系统阐明了EpoB通过作用于Tau蛋白来稳定微管的分子机制，超越了其已知的直接结合微管蛋白的作用模式。计算模拟与实验验证紧密结合，清晰地展示了EpoB作为“变构效应物”桥接Tau与微管蛋白的动态过程。 2. 发现的重要性： 首次在体内模型中证实，药理性稳定微管不仅能保护轴突、改善运输，还能使损伤后形成的、通常代表退变终点的轴突回缩球内部“重编程”，出现类似再生生长锥的有序微管结构。这为理解轴突退变与再生的转换提供了新见解。 3. 治疗策略的突破： 证明了微管稳定剂（EpoB）与促内在再生通路激活（PTEN敲低）的联合治疗具有叠加效应，这为开发针对中枢神经损伤的联合疗法提供了重要的临床前依据。 4. 研究体系的完整性： 研究从原子水平的计算模拟，到分子、细胞、组织、器官乃至功能层面，构建了一个非常完整且逻辑严谨的证据链。综合运用了分子动力学、多种动物模型、病毒标记、超微结构观察、电生理记录等先进技术，结论坚实可靠。 5. 转化潜力： EpoB是已知能穿透血脑/血视网膜屏障的微管稳定剂，其临床安全性已在抗癌研究中有所评估。本研究为其“老药新用”治疗神经损伤疾病奠定了坚实的科学基础，具有明确的转化医学价值。
六、 其他有价值的内容 研究团队在讨论部分也客观指出了本研究的局限性，例如未探讨神经炎症反应在其中的作用。他们提出，微管动力学与神经炎症的相互作用是未来需要优先探索的方向，这对于全面理解该治疗策略的潜力和转化路径至关重要。此外，文中对EpoB在视网膜和视神经中调节Tau水平差异的可能原因（如轴突运输障碍、蛋白滞留等）进行了深入探讨，体现了严谨的科学思维。