本研究报告发表于国际知名期刊 《Advanced Healthcare Materials》，论文题目为 “3D Bioprinting of Prevascularized Bone Organoids for Rapid In Situ Cranial Bone Reconstruction”。论文在线发表日期为2025年5月13日，其数字对象唯一标识符（DOI）为 10.1002/adhm.202501376。
该研究由来自中国顶尖研究机构的多位学者合作完成。通讯作者为 Yongcong Fang、Bin Yang 和 Zhuo Xiong。具体作者单位包括：中国医学科学院、北京协和医学院整形外科医院（Jing Duan， Bin Yang）；清华大学机械工程系生物制造中心、生物制造与快速成型技术北京市重点实验室、生物制造与工程生命系统国际人才创新基地（111基地）、高端装备界面科学与技术全国重点实验室、清洁高效透平动力装备全国重点实验室（Yongcong Fang， Yueming Tian， Zhuo Xiong）；北京大学第三医院骨科（Ziyu Wang）。这种跨学科、跨机构的合作模式，整合了临床医学、生物材料、生物制造和基础研究的优势，为研究的成功奠定了基础。
本研究属于骨组织工程（Bone Tissue Engineering， BTE） 与发育工程（Developmental Engineering） 交叉领域。颅骨临界尺寸骨缺损因其有限的自我再生能力，一直是临床修复的重大挑战。传统的“自上而下”骨组织工程策略，即将细胞接种于生物材料支架上，常面临细胞分布不均、营养扩散不足、难以模拟复杂骨结构，以及最关键的是缺乏有效的血管化网络，导致移植物核心区域细胞坏死或生长停滞。
近年来的研究转向“自下而上”的发育工程策略，即利用细胞聚集体（如间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells， MSCs）球体）作为构建单元来组装组织。然而，此类MSCs聚集体通常需要较长的体外成骨诱导时间，且缺乏足够的血管化，难以实现快速的原位成骨。
针对上述瓶颈，本研究提出了一种创新的解决方案：通过结合MSCs、人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells， HUVECs）和成骨微颗粒（Microparticles， MPs），大规模制备具有自组织血管化和增强成骨特性的预血管化骨类器官（Prevascularized Bone Organoids）。研究旨在系统地评估不同成骨微颗粒的效能，筛选出最优材料，阐明其促骨机制，并进一步将该骨类器官作为“生物墨水”（bioink），通过3D生物打印（3D Bioprinting） 技术构建具有高细胞密度和成骨能力的复杂组织，最终在大鼠临界尺寸颅骨缺损模型中验证其促进快速血管化骨组织形成及原位再生的能力。简言之，本研究的目标是开发一种集快速成骨、自血管化和个性化制造于一体的新型骨再生策略。
本研究遵循一条清晰、递进的技术路线，主要包含以下五个核心步骤：
1. 预血管化成骨聚集体的制备、表征与优化 * 研究对象与处理：研究首先采用“强制聚集法”，将MSCs与HUVECs以一定比例混合，并分别与四种不同的成骨微颗粒——羟基磷灰石（Hydroxyapatite， HAp）、生物活性玻璃（Bioactive Glass， BG）、氧化石墨烯（Graphene Oxide， GO）以及聚多巴胺（Polydopamine， PDA）涂层的HAp颗粒进行共培养，形成复合细胞聚集体。微颗粒与MSCs的比例设定为1:1（约1.2×10⁶颗粒与6×10⁵ MSCs/孔），该比例基于前期研究，能在颗粒-细胞相互作用与促分化效果间取得平衡。 * 实验方法：形成的聚集体在Aggrewell 400孔板中培养3天以形成稳定球体。随后，通过显微镜测量聚集体直径；采用钙黄绿素-AM/碘化丙啶（Calcein-AM/PI）活死染色评估7天和14天内的细胞活力；使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况。最关键的是，通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR） 在培养第7天和第14天检测了关键的成骨相关基因表达水平，包括早期标志物碱性磷酸酶（ALP）和I型胶原（COL-1）、中期标志物Runt相关转录因子2（RUNX-2）和骨形态发生蛋白2（BMP-2）、以及晚期标志物骨桥蛋白（OPN）。同时，对培养14天的聚集体进行COL-1的免疫荧光染色，从蛋白水平验证成骨分化。 * 数据分析流程：基因表达数据以未添加微颗粒的对照组（仅含MSCs和HUVECs）为基准进行归一化。所有定量数据通过GraphPad Prism软件进行统计分析，采用单因素或双因素方差分析（ANOVA），以p < 0.05为具有统计学显著性差异。
2. GO负载的预血管化骨类器官的生成与功能评估 * 研究对象：基于第一步的筛选结果，选择促骨效果最优的GO微颗粒，制备GO负载的预血管化骨类器官（M+H+GO组），并与不含GO的预血管化聚集体（M+H组）进行对比。 * 实验方法： * 形貌与结构：通过光学显微镜、扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察聚集体的形貌、表面结构以及GO片层与细胞的相互作用。 * 成骨潜能：对培养14天的聚集体进行ALP染色（检测早期成骨活性）和茜素红S（Alizarin Red S， ARS）染色（检测晚期钙结节矿化）。通过SEM观察矿化沉积情况。 * 血管生成潜能：将聚集体包埋于胶原I-Matrigel基质中，在3、8、13小时观察并量化HUVECs形成的管状网络结构（分支数、管长、连接点数）。通过免疫荧光染色检测血管内皮标志物CD31（血小板内皮细胞黏附分子）的表达，以确认聚集体内部的自组织毛细血管网络。 * 数据逻辑：此步骤旨在验证GO的加入是否在增强成骨的同时，保留了由HUVECs介导的自血管化能力。
3. 预血管化骨类器官体外培养的分子机制探索 * 研究对象：培养7天的M+H+GO组和M+H组细胞聚集体。 * 实验方法：对两组样本进行mRNA测序（RNA-Seq） 分析。测序数据经过质控、比对（使用HISAT2）和基因表达定量（计算FPKM值）后，利用DESeq2进行差异表达基因（Differentially Expressed Genes， DEGs）分析。对DEGs进行基因本体论（Gene Ontology， GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）通路富集分析，以识别受GO影响的关键生物学过程和信号通路。特别地，使用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis， GSEA）重点研究了富集到的关键通路。 * 验证实验：基于测序分析结果（显示“黏着斑”（Focal Adhesion）和“PI3K/Akt信号通路”显著富集），通过RT-qPCR和蛋白质印迹法（Western Blot）定量验证了通路中关键基因（如COL1A1， FAK (PTK2)， PI3K， Akt， β-catenin）和蛋白（COL1A1， PI3K (p85α)， Akt）的表达水平。 * 数据逻辑：此部分从转录组层面系统揭示了GO促进MSCs成骨分化的潜在分子机制，将材料学效应与细胞内信号传导联系起来，为GO的应用提供了理论基础。
4. 基于3D生物打印的预血管化骨类器官规模化制备 * 研究对象：以甲基丙烯酰化明胶（Gelatin Methacryloyl， GelMA）水凝胶为载体，负载预血管化骨类器官（体积分数60%）作为复合生物墨水。 * 实验方法： * 材料优化：通过流变仪测试了5.0%、7.5%、10.0%三种浓度GelMA的温度响应性、剪切稀化和应变屈服特性，最终选择7.5%浓度以平衡打印性能和细胞相容性。 * 打印过程：使用商业3D生物打印机，在15-30°C的挤出温度下，以优化的打印速度（1.2 mm/s）和挤出速率（0.1 mm³/s）进行打印。打印完成后立即用405 nm可见光照射30秒进行光交联固化。 * 打印后评估：打印后立即进行活死染色评估细胞存活率。在培养的第1、3、7天，通过免疫荧光染色观察细胞骨架（F-actin）的形态变化和CD31表达。为了直观示踪，还使用了表达绿色荧光蛋白（GFP）的MSCs和表达红色荧光蛋白（RFP）的HUVECs，通过共聚焦显微镜动态观察打印结构内细胞网络的整合与血管芽生情况。
5. 预血管化骨类器官促进颅骨缺损原位成骨的体内验证 * 动物模型：使用5周龄雄性SD大鼠，在颅骨双侧制造直径4 mm、深1 mm的临界尺寸骨缺损模型。 * 实验分组：将大鼠随机分为四组：空白对照组（缺损处无填充）、M+H组（植入含MSCs和HUVECs聚集体的GelMA）、M+GO组（植入含MSCs和GO颗粒聚集体的GelMA）、M+H+GO组（植入含预血管化骨类器官的GelMA）。 * 评估方法与时间点：植入后4周和8周进行系统评估。 * 骨再生评估：采用微型计算机断层扫描（Micro-CT） 进行三维成像，并定量分析骨体积分数（BV/TV）、骨矿物质密度（BMD）和新骨面积。8周时，取颅骨样本进行石蜡切片和H&E染色、Masson三色染色，以及骨钙素（Osteocalcin， OCN）的免疫荧光染色与定量分析。 * 血管化评估：植入8周后，通过磁共振血管成像（Magnetic Resonance Angiography， MRA） 对缺损区域的新生血管网络进行3D可视化成像并定量血管体积。同时，对组织切片进行CD31免疫荧光染色，定量分析血管密度。 * 免疫反应评估：对8周时的组织切片进行M1型巨噬细胞标志物CD68和M2型巨噬细胞标志物CD163的免疫荧光双染色，计算CD163/CD68的比值，以评估植入物的免疫调节作用（促炎向抗炎/修复表型转化）。
1. GO微颗粒展现出最优的成骨诱导能力。 在对比的四种微颗粒（HAp， BG， GO， PDA-coated HAp）中，GO负载的聚集体在几乎所有成骨标志基因（ALP， COL-1， RUNX-2， BMP-2， OPN）的表达上均显示出最高的上调倍数（例如，14天时ALP上调6.42倍，COL-1上调8.72倍）。免疫荧光染色也证实GO组的COL-1蛋白表达最强。细胞活力与增殖实验表明所有微颗粒均具有良好的生物相容性。因此，研究选定GO作为后续构建骨类器官的关键成骨组分。
2. GO负载的预血管化聚集体兼具卓越的成骨与血管生成双重功能。 ALP和ARS染色结果显示，M+H+GO组的早期成骨活性和晚期钙盐沉积均显著强于M+H组。Matrigel管形成实验表明，含有HUVECs的M+H组和M+H+GO组均能快速形成复杂的管状网络（3小时即已形成），且两者在分支数、管长和连接点数量上无显著差异，说明GO的加入并未损害HUVECs的自组装和血管生成能力。聚集体内部的CD31染色进一步证实了毛细血管网络的存在。这些结果证明，成功构建了兼具“成骨”与“血管化”核心功能的骨类器官。
3. 转录组学揭示GO主要通过激活黏着斑和PI3K/Akt通路促进成骨。 RNA-Seq分析共鉴定出1523个DEGs（879个上调，644个下调）。KEGG和GSEA分析均显著富集到“黏着斑”和“PI3K/Akt信号通路”。Western Blot验证显示，M+H+GO组中COL1A1、PI3K (p85α) 和Akt的蛋白表达量分别是M+H组的1.83、1.97和2.00倍。机制推测为：GO片层通过物理相互作用激活细胞整合素，启动黏着斑复合物组装和机械转导信号（如YAP/TAZ），同时通过FAK激活PI3K/Akt/β-catenin通路，二者协同作用，最终上调RUNX2等核心转录因子，驱动成骨分化和细胞外基质（富含I型胶原）矿化。
4. 骨类器官生物墨水成功实现高精度3D生物打印并维持细胞功能。 7.5% GelMA展现出理想的打印性能。打印后的细胞存活率高达85.63%。培养过程中，聚集体内的细胞逐渐伸展、迁移并相互连接，在GelMA支架内形成复杂的3D网络。使用荧光标记细胞进行活体成像，清晰观察到RFP-HUVECs沿着GFP-MSCs形成的“桥梁”进行芽生，形成了原始的血管网络，证明了打印后结构的生物学活性得以保留。
5. 预血管化骨类器官在大鼠颅骨缺损模型中实现快速、有效的血管化骨再生。 * 骨再生方面：Micro-CT定量分析显示，植入8周后，M+H+GO组的骨再生指标全面领先：BV/TV (32.28%) 分别是M+H组、M+GO组和空白组的2.13、2.32和4.11倍；BMD和新骨面积也呈现相同趋势。H&E和Masson染色证实M+H+GO组缺损区几乎被新生骨组织完全填充，胶原排列有序。OCN免疫荧光定量也显示M+H+GO组信号最强（6.11%），显著高于其他组。 * 血管化方面：MRA 3D成像和CD31染色一致表明，M+H组和M+H+GO组的血管密度和体积显著高于M+GO组和空白组。这直接证明了共培养HUVECs所带来的促血管生成优势。 * 免疫调节方面：M+H+GO组和M+GO组缺损区的M2/M1型巨噬细胞比值（约2.05-2.06）显著高于M+H组和空白组（约0.45-0.50）。这表明GO具有诱导巨噬细胞向促修复、抗炎的M2表型极化的免疫调节能力，而M2型巨噬细胞分泌的血管内皮生长因子（VEGF）等因子可能进一步促进了血管生成，形成了“免疫调节-血管生成-成骨”的良性循环。
本研究成功开发并验证了一种基于发育工程理念的颅骨再生新策略。该策略的核心在于创造了一种新型的“预血管化骨类器官”，它通过整合MSCs、HUVECs和GO成骨微颗粒，在体外即具备自组织的血管网络和增强的成骨潜能。进一步，利用3D生物打印技术，可将这些功能化的“活体构建单元”精确组装成形状适配、细胞密度高、兼具成骨与血管化预告的个性化骨移植物。
科学价值： 1. 机制创新：系统比较并确定了GO在多种成骨材料中的最优效能，并首次在3D聚集体模型中从转录组层面阐明了GO通过协同激活“黏着斑”和“PI3K/Akt”通路促进成骨分化的分子机制。 2. 概念整合：将“类器官”、“预血管化”和“生物打印”三个前沿概念创新性地融合，实现了从“功能化细胞单元”到“厘米级复杂组织”的跨越，为组织工程提供了“自下而上”与“宏观制造”相结合的新范式。 3. 功能耦合：揭示了GO不仅促进成骨，还具有免疫调节作用（促M2极化），这可能间接增强了血管生成和骨再生，展现了材料多功能化在组织修复中的协同效应。
应用价值： 1. 解决临床痛点：直接针对临界尺寸骨缺损修复中“血管化不足”和“成骨速度慢”两大核心难题，提供了一种有望实现快速原位骨再生的解决方案。 2. 个性化治疗潜力：3D生物打印技术使移植物能够精确匹配患者特定的骨缺损形状，具有良好的临床转化前景。 3. 平台技术扩展性：该策略作为一个通用平台，可通过更换细胞类型、微颗粒或生物材料，应用于其他类型组织（如软骨、肌肉等）的再生，推动发育工程在再生医学中的广泛应用。
这项研究代表了一种先进的、