关于开发和应用一种新的梅毒螺旋体多位点序列分型方案的研究报告

本研究由以Linda Grillová和Philipp P. Bosshard*为代表的来自捷克、瑞士、法国、德国、西班牙等多国研究机构的研究团队共同完成，其成果以题为“Molecular characterization of Treponema pallidum subsp. pallidum in Switzerland and France with a new multilocus sequence typing scheme”的论文形式，于2018年7月30日发表于学术期刊 *PLOS ONE*。

一、 研究背景与目的

梅毒是一种由苍白密螺旋体苍白亚种（Treponema pallidum subsp. pallidum, TPA）引起的性传播疾病，是全球重要的公共卫生问题，近年来发病率在全球范围内呈上升趋势。对病原体进行分子分型是理解其流行病学、传播动态、种群结构以及与表型特征（如致病性和抗生素耐药性）关联的关键。然而，TPA无法在体外连续培养，这限制了对临床菌株的深入研究。历史上，基于实验室兔传代菌株的全基因组数据或临床样本中单个基因的分析，发展出了几种TPA分子分型方案，如CDC分型（CDCT）、增强型CDC分型（ECDCT）和基于测序的分子分型（SBMT）。但这些方案存在一些局限性，例如分型位点（如 arp 和 tpr 基因）可能存在菌株内变异导致结果不一致，以及对当代主要流行株系（SS14谱系）的分辨率较低。

随着基于富集技术和下一代测序（NGS）直接从临床样本获取TPA全基因组数据成为可能，研究人员获得了更丰富的基因组信息，为设计更优的分型方案奠定了基础。因此，本研究旨在：1）基于对现有TPA全基因组数据的分析，筛选出具有高分辨率的候选分型位点；2）构建一个新的、高分辨率的TPA多位点序列分型（MLST）方案；3）将该新方案应用于来自瑞士和法国的120份临床样本，以评估其效能并分析当地TPA的分子流行病学特征。

二、 研究流程与方法

本研究的工作流程系统而严谨，主要包含以下几个关键步骤：

1. 分型方案的设计与候选位点筛选： 研究团队首先收集了30个完整的或草图的TPA基因组序列（包括兔传代参考菌株和直接从临床标本测序的菌株），这些样本采集时间跨度从1912年至2013年，覆盖了TPA的两个主要谱系（SS14和Nichols）。基于这些基因组数据，研究人员设定了筛选候选分型位点的标准：位点需包含至少4个可变位点且单核苷酸变异（SNV）密度 > 0.001（分别高于Nichols谱系和SS14谱系平均SNV密度的10倍和50倍）；在每个谱系内至少显示两种不同的单倍型；SNV分布不宜过于分散以便设计短扩增子。通过分析，最终从整个基因组中筛选出五个候选基因：tp0136, tp0462, tp0548, tp0705 和 *tp0865*。其中，tp0136 的SNV密度最高。

2. 临床样本收集与处理： 研究分析了2011年9月至2015年5月期间，从瑞士（苏黎世、日内瓦、洛桑）和法国（里昂、巴黎）门诊收集的120份早期或分期不明的梅毒患者样本，包括119份病变拭子和1份组织样本。对所有样本进行了DNA提取和针对TPA的常规实时荧光定量PCR（qPCR）诊断。

3. 候选位点扩增、测序与数据分析： 对上述五个候选基因以及与大环内酯类抗生素耐药性相关的 23S rRNA 基因，采用巢式PCR结合 touchdown 程序进行扩增。PCR产物纯化后进行Sanger测序。使用Lasergene软件进行序列分析。对于 23S rRNA 基因，重点检查了与大肠杆菌 23S rRNA 基因第2058和2059位点相对应的突变（A2058G或A2059G），这些突变已知与对大环内酯类药物的耐药性相关。为了评估新方案的分辨率，研究人员将五个候选位点（共87个可变位点）的串联序列所构建的中值连接网络（Median-Joining network），与基于全基因组数据（768个可变位点）构建的网络进行了比较。结果显示，仅使用其中三个位点（tp0136, tp0548, *tp0705*）即可达到与使用全部五个位点相同的分辨率。因此，最终确定以这三个位点构建新的MLST方案。

4. MLST方案的应用与比较： 将新建立的MLST方案应用于临床样本。每个菌株的等位基因谱由三个数字代码表示，分别对应 tp0136, tp0548, tp0705 的等位基因型（例如 1.3.1）。同时，为了与传统方法比较，研究也对部分样本进行了ECDCT和SBMT分型，以评估新MLST方案的分辨能力。

5. 分型稳定性与流行病学一致性验证： 为了测试新MLST方案的稳定性，研究人员对TPA参考菌株DAL-1在兔子体内连续传代142天（约114代）的11个代次样本进行了所有位点的扩增，确认分型结果是否一致。此外，对来自捷克共和国5名有流行病学关联患者的样本进行了分型，以验证方案在追踪传播链中的一致性。

6. 系统发育与统计分析： 使用MEGA 6软件构建最大似然法（Maximum Likelihood）系统发育树，并使用Network软件构建中值连接网络，以可视化不同等位基因型和菌株谱系之间的关系。利用统计方法（如Fisher精确检验、Kruskal-Wallis检验）分析了遗传特征（如大环内酯耐药性、等位基因谱、谱系）与患者临床特征（如来源地、男男性行为者状态、年龄、性别、HIV感染情况、血清学结果、梅毒分期）之间的潜在关联。

三、 主要研究结果

1. 新MLST方案的构建与验证： 研究证实，由 tp0136, tp0548, tp0705 三个位点组成的MLST方案具有高分辨率。tp0136 和 tp0548 能清晰区分SS14和Nichols两个主要遗传谱系（分别含有41个和30个简约信息位点），而 tp0705 则在谱系内部，特别是对SS14谱系内的菌株，提供了进一步的分辨能力。该方案能够区分TPA与其他密螺旋体亚种，区分TPA的两个主要谱系，并能对谱系内的菌株进行分型，其分辨率达到了全基因组数据分辨率的30%以上。

2. 瑞士和法国临床样本的分子特征： 在120份临床样本中，97份（80.8%）至少有一个MLST位点PCR阳性，其中54份（45%）获得了完整的分型结果（三个位点均成功测序）。共鉴定出23种不同的等位基因谱（SS14谱系18种，Nichols谱系4种，1种未确定）。其中，等位基因谱1.1.1和1.3.1（均属于SS14谱系）最为常见，合计占完全分型样本的67%。等位基因谱1.3.1是唯一在2011-2015年所有五个研究城市中每年都被检测到的谱系。仅有9份样本（9.3%）属于Nichols谱系，且全部来自苏黎世。

3. 大环内酯耐药性流行率高： 在成功扩增 23S rRNA 基因的79份样本中，63份（79.7%）携带与大环内酯耐药相关的突变（A2058G突变60份，A2059G突变3份）。耐药性在SS14和Nichols谱系中均有发现（分别为81%和60%），且在所有测试地点（洛桑100%、巴黎85.7%、里昂83.3%、苏黎世80%、日内瓦62.5%）都维持在较高水平。统计分析显示，等位基因谱1.3.1与大环内酯耐药性显著相关。

4. 新MLST方案与传统方案的比较： 新MLST方案在97份可分型样本中鉴定出23种等位基因谱，显示出最高的分辨能力。相比之下，SBMT在99份可分型样本中鉴定出19种基因型，ECDCT在89份可分型样本中鉴定出15种亚型。特别是，MLST能将ECDCT中的亚型14d/g进一步细分为5种不同的等位基因谱。这表明新方案具有更精细的分型能力。

5. 分型稳定性与流行病学关联验证： 对DAL-1菌株连续传代11次的样本进行MLST分型，所有代次均显示相同的等位基因谱，证明了该方案在实验室传代过程中的稳定性。对5名流行病学相关患者的样本进行分型，结果完全一致，支持了该方案在追踪传播链中的可靠性。

6. 临床关联性分析： 除了发现Nichols谱系菌株全部来自苏黎世存在地域关联外，未发现其他等位基因谱或谱系与患者的年龄、性别、HIV感染状态、血清学结果或梅毒分期等临床特征之间存在统计学上的显著关联。

四、 研究结论与意义

本研究成功开发并验证了一种用于苍白密螺旋体苍白亚种（TPA）的新型多位点序列分型（MLST）方案。该方案基于 tp0136, tp0548, tp0705 三个基因位点的序列分析，并结合 23S rRNA 基因的耐药性检测，具有高分辨率、高稳定性和良好的流行病学一致性。

其科学价值在于：1）提供了更优的分型工具：相比以往的分型方案，新MLST方案能更有效地区分TPA的两个主要谱系及其内部变异，尤其提升了对当前主导的SS14谱系的分辨能力，为精细的分子流行病学研究奠定了基础。2）揭示了地区流行特征：首次系统报告了瑞士和法国部分地区TPA的遗传多样性和大环内酯耐药率，显示SS14谱系占绝对优势，且大环内酯耐药率极高（约80%），这对临床用药指南（如不建议将阿奇霉素作为青霉素过敏者的二线治疗）提供了重要的本地数据支持。3）促进了数据整合与比较：新方案与广泛使用的SBMT方案共享 tp0136 和 tp0548 位点，便于与历史数据进行比对和整合，有利于全球范围内的协作研究。

其应用价值在于：该方案易于在具备测序设施的标准实验室中快速实施，成本效益较高。它有望成为公共卫生部门和研究机构追踪梅毒感染、监测耐药菌株传播、研究特定菌株与高危人群关联以及纵向监测菌株类型变化的有效工具，从而增进对梅毒再度流行背后因素和模式的理解。

五、 研究亮点

1. 基于全基因组数据的理性设计：不同于以往基于有限基因或经验性选择的分型方案，本研究基于对30个TPA全基因组数据的系统性生物信息学分析，科学筛选出具有最高分辨潜力的分型位点，确保了方案的高效性和先进性。
2. 高分辨率与稳定性兼备：新MLST方案在保持对TPA两个主要谱系区分能力的同时，显著提高了对SS14谱系内部菌株的分辨率。通过实验室传代和流行病学关联样本验证，证明了其分型结果的稳定性，克服了传统CDC分型中因 arp/tpr 基因不稳定可能导致的亚型差异问题。
3. 集成耐药性检测：方案将 23S rRNA 基因的耐药突变检测作为标准组成部分，使得在获得分型信息的同时，能直接获取关键的抗生素耐药性信息，对临床治疗和公共卫生监测具有即时指导意义。
4. 跨国合作与临床验证：研究整合了多国多中心的临床样本（瑞士和法国5个城市），并对120份临床样本进行了实际应用测试，不仅验证了方案的可行性，也提供了宝贵的区域性流行病学数据。

六、 其他有价值的内容

研究还通过系统发育分析，将新MLST方案分型的等位基因谱与全球其他研究中使用ECDCT和SBMT分型的菌株进行了比较。结果显示，瑞士和法国的样本与之前研究中发现的7种亚型聚集在一起，同时发现了两种新的SS14谱系亚型（对应于MLST中的 tp0548 等位基因5和11，在ECDCT命名中为Y和Z），这丰富了全球TPA基因型的数据库，并提示可能存在地区特有的传播谱系。此外，研究确认了 tp0548 基因在TPA与引起非性病性梅毒（Bejel）的 T. pallidum subsp. endemicum (TEN) 以及引起雅司病（Yaws）的 T. pallidum subsp. pertenue (TPE) 之间存在潜在重组事件，这为了解密螺旋体亚种间的进化关系提供了线索。