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Halomonas bluephagenesis TD01的基因组规模代谢模型构建与工业应用稳定性提升研究

一、作者与发表信息
本研究由清华大学陈国强教授团队（通讯作者）与瑞典查尔姆斯理工大学Jens Nielsen教授团队合作完成，第一作者为张立展（Lizhan Zhang）和叶建文（Jian-Wen Ye）。研究成果发表于《Nucleic Acids Research》期刊，论文标题为”A long-term growth stable Halomonas sp. deleted with multiple transposases guided by its metabolic network model Halo-ECGEM”。

二、学术背景
1. 研究领域：本研究属于合成生物学与代谢工程交叉领域，聚焦于嗜盐菌Halomonas bluephagenesis TD01的基因组规模代谢网络模型（Genome-scale metabolic model, GEM）构建及其在下一代工业生物技术（Next Generation Industrial Biotechnology, NGIB）中的应用。
2. 研究动机：Halomonas bluephagenesis TD01因其耐高盐、耐碱特性成为NGIB的理想底盘细胞，但其基因组不稳定性（如转座酶介导的突变）和代谢调控机制不明限制了工业化应用。
3. 科学问题：如何解析该菌株的应激响应机制？如何通过模型指导提升其工业生产的稳定性？
4. 研究目标：
- 完成TD01的全基因组测序与注释
- 构建酶约束型代谢模型（Enzyme-constrained GEM, ECGEM）
- 鉴定影响稳定性的关键转座酶并构建长期稳定的工业菌株

三、研究流程与方法
1. 全基因组测序与多组学分析
- 样本处理：使用PacBio和Illumina平台完成TD01染色体（4.14 Mb, GC含量52.68%）和质粒的测序，注释3,928个CDS。
- 多条件培养：设置盐胁迫（20/60/100 g/L NaCl）、高氮（3.6 g/L尿素）和分批补料发酵（9/19/30 h）三组条件，采集转录组（RNA-seq）和绝对定量蛋白质组（TMT标记LC-MS/MS）数据。
- 创新方法：开发连续变异轨迹分析（Continuous Variation-response Trajectory, CVT），将差异表达基因分为8类调控模式（如线性正/负调控、条件特异性上调等）。

1. 代谢模型构建与优化

   • Halo-GEM构建：以E. coli模型iML1515为模板，通过双向最佳匹配（BBH）比对添加1,889个基因关联的代谢反应，手动填补PHB合成途径。
     
   • Halo-ECGEM开发：整合蛋白质组数据，采用GO-slim术语（84类）约束酶活性，通过贝叶斯统计校准kcat值（迭代400次）。
     
   • 模型验证：
     
     • 单因素分析：预测尿素、磷酸盐对PHB合成的抑制效应与实验数据一致（R²>0.85）
       
     • 7L发酵模拟：氧限制条件下PHB产量预测误差%
       

2. 转座酶删除与稳定性验证

   • 靶点筛选：根据转录组从21个转座酶中选定8个高表达基因（如TD01GL001444）。
     
   • 基因编辑：采用CRISPR/Cas9在工业菌株WZY278中敲除目标基因，获得WZY278ΔTns。
     
   • 稳定性测试：
     
     • 摇瓶实验：4个克隆传代3次，干重（DCM）变异系数%
       
     • 7L发酵：PHB产量达96 g/L（占DCM 75%），批次间差异%
       

四、主要研究结果
1. 基因组与应激响应特征
- 鉴定1,188个持家基因（占基因组30.2%），其中134个为必需基因（如EDD途径基因TD01GL001444）。
- 盐胁迫下，翻译相关GO术语（如”蛋白代谢过程”）占用60%蛋白质资源，但全局翻译速率下降50%（图2）。

1. 代谢模型性能

   • Halo-ECGEM的kcat值分布与E. coli模型高度一致（K-S检验p>0.05），GO-slim约束使计算效率提升3倍（图6）。
     
   • 预测葡萄糖→PHB转化率为52%，与实验值46%吻合。
     

2. 工业菌株稳定性

   • 转座酶删除使代谢通量波动降低40%（FVA分析）。
     
   • WZY278ΔTns在PHBV（3HV摩尔比3%）和P34HB（4HB摩尔比14%）生产中均表现稳定（图7）。
     

五、结论与价值
1. 科学价值：
- 首次建立Halomonas的ECGEM模型，揭示其”翻译主导”的应激调控范式。
- 提出GO-slim术语分层约束策略，为原核生物模型优化提供新方法。
2. 应用价值：
- WZY278ΔTns菌株解决了NGIB中遗传不稳定的瓶颈问题。
- 模型指导的7L发酵工艺使PHB产量达到工业化标准。

六、研究亮点
1. 方法创新：
- CVT分析首次实现应激响应轨迹的可视化分类。
- 开发基因组规模最小的工业菌株（删除8个非必需转座酶）。
2. 技术整合：多组学数据（基因组/转录组/蛋白质组）与代谢模型的深度耦合。

七、其他发现
1. 鉴定rrna甲基转移酶为高翻译成本的关键基因（经济-精度调控节点）。
2. 发现氧限制是PHB高产的核心因素（代谢流分析显示氧消耗与PHB合成负相关）。

该研究通过系统性整合实验与计算生物学，为极端环境微生物的工业化应用提供了范式。模型代码已开源（GitHub: sysbiochalmers/halo-gem），数据集可通过通讯作者获取。