本研究由Cangsong Liao和Florian P. Seebeck完成，通讯作者Florian P. Seebeck来自瑞士巴塞尔大学化学系（Department for Chemistry, University of Basel, Basel, Switzerland）。该研究成果以Article形式发表于Nature Catalysis，DOI为10.1038/s41929-019-0300-0。

学术背景

生物催化（biocatalysis）已成为食品、制药和材料领域绿色工业创新的关键技术。水解酶、醛缩酶、转氨酶和加氧酶等酶类因能在温和条件下催化困难反应而被成功应用于多种商业过程。S-腺苷甲硫氨酸（s-adenosyl methionine, SAM）依赖性甲基转移酶（SAM-dependent methyltransferases, SAM-dependent MTs）是生物催化工具箱中极具潜力的补充。甲基化是天然产物生物合成和信号转导中的常见反应，将甲基引入小分子或大分子生物分子可显著改变其理化性质；在药物化学中，甲基化也是优化候选化合物效力和药代动力学性质的重要策略。然而，尽管酶促甲基化具有高度区域选择性（regioselectivity）、化学选择性（chemoselectivity）和立体选择性（stereoselectivity），SAM依赖的甲基转移酶在体外的应用却受到SAM作为化学计量共底物（stoichiometric co-substrate）的限制：SAM化学结构复杂、相对不稳定且价格昂贵。细胞内虽然存在SAM再生循环，但已报道的体外重构系统包含6种酶和14种代谢物，实施困难、放大成本高且难以通过蛋白质工程改造。因此，本研究旨在构建一种更简单、更具通用性的SAM循环再生系统，使SAM依赖性甲基转移酶能够用于天然产物的制备规模甲基化反应。

研究的详细工作流程

本研究首先进行概念设计（concept）。SAM的锍（sulfonium）基团在动力学上稳定，但热力学反应活性高，几乎可将甲基转移给任何亲核体（N、C、O、P、S）且自由能变化为负。卤化物甲基转移酶（halide methyltransferases, HMTs）在自然界中负责使用SAM作为甲基供体、以碘化物、溴化物和氯化物为受体生产卤代甲烷。由于氢卤酸是强酸，SAM向卤化物的甲基转移在热力学上为吸能反应，因此反向反应——HMT利用碘甲烷（methyl iodide）将甲基转移至S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosyl homocysteine, SAH）生成SAM——在适当体外条件下应当可行。基于此，研究者提出以SAH作为催化性烷基载体、以碘甲烷作为化学计量甲基供体的SAM再生策略。

第一步，研究者生产并纯化了来源于嗜热氯酸杆菌（Chloracidobacterium thermophilum）的卤化物甲基转移酶HMT，并验证了其在生理条件下可将SAH转化为SAM。在pH 8的100 mM磷酸盐缓冲液中，HMT催化SAH甲基化的动力学参数为：kcat为0.33±0.03 s⁻¹，碘甲烷的Km为6.5±1.4 mM，SAH的Km为0.17±0.04 µM。HMT对SAH表现出极高的底物亲和力，这一特征后来被证明对级联反应效率至关重要。

第二步，研究者构建了HMT与EgtD的甲基转移级联反应。EgtD是来源于耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）的组氨酸特异性甲基转移酶，催化SAM向组氨酸的三次甲基转移，依次经过Nα-单甲基组氨酸和Nα-二甲基组氨酸中间体，最终生成Nα-三甲基组氨酸（trimethyl histidine, TMH）。在以1 mM组氨酸、6 mM碘甲烷、50 μM SAH、10 μM EgtD和10 μM HMT的反应体系中，TMH的初始生成速率为(1.1±0.1)×10⁻² µM s⁻¹，23小时后约15%的组氨酸被转化，相当于每个SAH分子被重新甲基化9次。然而，HPLC分析显示SAH在反应过程中被水解为腺嘌呤（adenine）和核糖基高半胱氨酸（ribosyl homocysteine），初始速率为(7±1)×10⁻³ µM s⁻¹。该速率显著高于SAH自发脱嘌呤的速率常数（k=1×10⁻⁵ s⁻¹），提示HMT和EgtD制剂中存在SAH核苷酶（SAH nucleosidase, EC 3.2.2.9）污染。经检测，HMT和EgtD制剂中SAH核苷酶活性约为每毫克蛋白1×10⁻⁵ μmol s⁻¹。

为降低SAH核苷酶污染，研究者通过凝胶过滤层析（gel filtration）对两种酶进行进一步纯化，使SAH水解初始速率降低两倍至(4±0.3)×10⁻³ µM s⁻¹，SAH的半衰期显著延长，级联反应可实现SAH高达30次循环，组氨酸转化为TMH的转化率达到51%。但SAH降解仍然限制转化数和产率。

为彻底消除SAH核苷酶污染，研究者从Keio菌株库（JW0155-1）中构建了一株敲除mtn基因（编码SAH核苷酶）的大肠杆菌菌株，并进一步删除了基因组中的卡那霉素抗性盒并引入T7 RNA聚合酶基因，得到E. coli δmtn (DE3)菌株。该菌株中纯化的HMT所含SAH核苷酶活性低于每毫克蛋白1×10⁻⁶ μmol s⁻¹。使用该菌株表达的酶组装级联反应后，SAH降解速率降至(2.0±0.1)×10⁻⁵ s⁻¹，与文献报道的未催化自发反应速率一致。该反应体系中TMH初始生成速率提高至(4.8±0.3)×10⁻² μM s⁻¹，底物转化率达到94%，对应56次SAH再生循环。中间产物Nα-二甲基组氨酸的浓度在反应前20分钟升至18 μM，然后120分钟后降至1 μM以下。将底物浓度加倍后，产率和SAH循环次数也相应加倍。将EgtD浓度提高两倍后，底物转化率提升至99%。将SAH浓度降低2.5倍并未显著降低产率，反而使每个SAH分子的催化循环次数翻倍。此外，研究者还考察了碘甲烷用量的影响：在没有碘甲烷过量或略微过量的条件下（1当量或1.3当量），转化率仍可维持在93%–94%。当底物浓度从2 mM逐步增加至8 mM时，SAH循环次数从280增加至580，但转化率从92%降至48%，可能原因包括产物抑制和碘甲烷供应限制。最终，研究者在一个200 mL的反应中，以4 mM组氨酸和18 mM碘甲烷（1.5当量）进行HMT/EgtD级联反应，分离得到140 mg TMH，产率88%。

在动力学分析中，研究者测定了稳态下SAH和SAM的浓度：SAH约为2 μM，SAM约为48 μM。这意味着大部分可用的SAH都被HMT结合，从而避免了SAH对SAM依赖性甲基转移酶常见的产物抑制作用。HMT对SAH的高亲和力加上碘甲烷的高甲基转移势能，使体系能够维持类似活细胞内的高SAM/SAH比值。

研究者还系统考察了非特异性甲基化对反应体系的影响。在25°C、pH 8的条件下，6 mM碘甲烷与1 mM SAH孵育48小时后，仅产生160 μM甲醇、100 μM磷酸甲酯和185 μM磷酸二甲酯，未观察到SAH或组氨酸的非酶促甲基化。此外，研究者比较了HMT和EgtD在0或5 mM碘甲烷中孵育5或48小时后的催化活性，未发现显著的碘甲烷依赖性失活。高分辨电喷雾质谱（HR-ESI-MS）显示HMT蛋白被甲基化3次，而EgtD未检测到甲基化物种。液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）分析表明，被甲基化的片段均含有半胱氨酸残基，且这些甲基化片段不再与碘乙酰胺反应，证明甲基连接在半胱氨酸侧链的硫原子上。对其他甲基转移酶（IMT、PMT、SgvM和NovO）的相同LC-HRMS表征也证实：在所用体外催化条件下，碘甲烷仅特异性烷基化半胱氨酸残基。

为验证该系统的通用性，研究者将HMT共因子再生与四类不同SAM依赖性甲基转移酶联用：来源于冰叶日中花（Mesembryanthemum crystallinum）的肌醇4-甲基转移酶IMT（EC 2.1.1.129），催化肌醇（inositol）甲基化为ononitol；来源于腐败尸胺N-甲基转移酶PMT（EC 2.1.1.53），催化腐胺（putrescine）选择性单甲基化为N,N′-二甲基腐胺；来源于灰绿链霉菌（Streptomyces griseoviridis）的C-甲基转移酶SgvM，催化α-酮戊酸（α-ketovaleric acid）C3位的立体选择性甲基化；来源于新霉素生物合成途径的NovO，催化2,7-二羟基萘（2,7-dihydroxynaphthalene）的芳香环sp²碳甲基化。PMT/HMT和SgvM/HMT级联以20 μM SAH将2 mM底物几乎完全转化，分别对应87和100次循环；IMT/HMT和NovO/HMT级联因酶稳定性限制，在单次添加酶时仅转化约43%和35%，但分两次补加酶后转化率均超过90%。此外，研究者还使用氘代碘甲烷（deuterated methyl iodide）制备了氘代TMH，转化率96%，表明该系统可用于同位素标记。

主要结论

本研究证明，卤化物甲基转移酶HMT可与O-、N-或C-特异性的SAM依赖性甲基转移酶联用，构建高效的酶级联反应，以催化量的SAM/SAH和市售试剂碘甲烷为甲基供体，在制备规模上实现复杂天然产物的高选择性、近定量甲基化。该技术操作简单、易于实施，可作为天然产物研究和小规模化学酶法合成的工具。该系统的关键性特征在于：HMT对SAH的极高亲和力（Km=0.17 µM）保证了SAH在稳态下保持在低微摩尔浓度，从而有效避免SAM依赖性甲基转移酶的产物抑制；同时碘甲烷的高甲基转移势能驱动SAH再生。研究还表明，碘甲烷在体外催化条件下仅特异性烷基化半胱氨酸残基，对大多数不含必需半胱氨酸的甲基转移酶影响有限。

研究的意义与价值

本研究为SAM依赖性甲基转移酶的体外应用提供了一种实用且高效的SAM再生方案，突破了SAM作为化学计量试剂所导致的成本、稳定性和原子经济性限制。在科学价值层面，该工作首次证明SAH可作为催化性烷基载体，通过单一再生酶HMT和廉价甲基供体碘甲烷实现数百次SAM再生循环；同时，该研究阐明了HMT高底物亲和力与维持高SAM/SAH稳态比值之间的机理联系，为理解细胞内甲基化调控提供了体外模型。在应用层面，该技术使区域、化学和立体选择性的酶促甲基化成为天然产物化学和药物化学中可常规使用的合成工具，并可用于氘代标记化合物的制备。

研究亮点

本研究的核心亮点在于概念上的创新：利用HMT催化碘甲烷与SAH之间的甲基转移平衡，将SAH从“废物”转变为催化性甲基载体，从而以单一酶实现SAM再生，极大简化了此前6酶14代谢物的再生系统。另一重要发现是，通过使用SAH核苷酶缺陷的大肠杆菌宿主消除污染酶活性，使SAH的降解速率降至非催化自发水平，从而实现了580次的最大循环数。此外，该系统对多种不同化学类型（N、O、C）的甲基转移酶的适用性，以及碘甲烷对半胱氨酸残基的特异性烷基化特征，为后续开发更安全的甲基供体系统和改造对碘甲烷敏感的甲基转移酶提供了明确方向。