关于单克隆抗体溶液大规模冷冻过程中冷冻浓缩现象对长期冻存稳定性影响的研究报告

本研究由 Oliver Bluemel, Moritz Anuschek, Jakob W. Buecheler, Georg Hoelzl, Karoline Bechtold-Peters 与 Wolfgang Friess*（*通讯作者） 合作完成。作者单位包括德国慕尼黑大学（Ludwig-Maximilians-Universität München）药学院的药物技术与生物制药学系、瑞士诺华制药（Novartis Pharma AG）的技术研发部门以及奥地利山德士公司（Sandoz GmbH）。该研究成果发表于国际药学领域的学术期刊《International Journal of Pharmaceutics: X》，文章于2021年12月25日在线发表，正式卷期为第4卷（2022年），文章编号为100108。

一、 研究的学术背景

本研究的核心科学领域是生物制药，具体聚焦于治疗性单克隆抗体（mAb）的制剂工艺与稳定性科学。单克隆抗体是治疗多种疾病的关键药物，其市场规模正在迅速扩大。在单抗药物生产流程中，将原料药（Drug Substance）进行冷冻储存是一种常见工艺，旨在提高其化学和物理稳定性，并降低微生物生长的风险。冷冻储存也为生产制造和运输提供了灵活性。然而，冷冻过程远非一个简单可控的步骤，它涉及复杂的物理化学变化，可能对蛋白质稳定性构成潜在威胁。其中一个长期存在但尚未完全理解的挑战是“冷冻浓缩”（Cryoconcentration）现象。

冷冻浓缩是指在冷冻过程中，随着冰晶的形成和生长，溶质（包括蛋白质和低分子量辅料）被排挤到未冻结的区域，导致这些区域的溶质浓度远高于初始溶液浓度。传统观点认为蛋白质与小分子辅料会以同等程度浓缩，但近期研究表明，大分子蛋白质比小分子辅料更容易被捕获在冰晶中，导致两者在冷冻浓缩基质（Freeze-Concentrated Matrix, FCM）中的比例发生改变。这种现象在大规模容器（如本研究先前工作中使用的2升瓶）中尤为显著，会造成容器内不同区域出现溶质浓度和比例的差异。这种不均一性可能改变蛋白质的局部微环境，包括离子强度、粘度以及最重要的——最大冻结浓缩溶液的玻璃化转变温度（Tg‘），进而影响其在长期冻存期间的稳定性。尽管已有小规模研究探讨了冻存条件对蛋白质稳定性的影响，但将大规模冷冻产生的冷冻浓缩效应（特别是由此导致的蛋白与辅料比例变化）与长期冻存稳定性直接关联的系统研究尚属空白。因此，本研究旨在填补这一知识缺口，具体目标是：探究由冷冻浓缩导致的单克隆抗体与组氨酸缓冲盐比例变化，如何影响其在长期冻存期间（在-80°C、-20°C和-10°C下储存长达12个月）的稳定性，重点关注高分子量物种（Higher Molecular Weight Species, HMWs）和亚可见颗粒（Subvisible Particles, SVPs）的形成。

二、 研究的详细工作流程

本研究是一项系统的实验室规模稳定性研究，其工作流程主要包括样品制备、长期冻存稳定性测试、以及关键物化参数Tg‘的测定三个核心环节，并采用了多种分析技术进行表征。

首先，在样品制备阶段，研究人员并非使用随机浓度，而是基于他们先前一项研究（Bluemel et al., 2020）的实际发现。该研究发现，将单抗组氨酸缓冲液在2升瓶中大规模冷冻后，容器内不同区域的单抗和组氨酸浓度存在显著差异，导致单抗与组氨酸的比例（mAb:His）发生变化。本研究聚焦于五个关键区域对应的浓度比例：（1）初始浓度（比例1.61）；（2）最大单抗浓度区（比例1.50）；（3）最小单抗浓度区（比例1.16）；（4）最大组氨酸浓度区（比例1.00）；（5）最小组氨酸浓度区（比例2.58）。他们精确配制了代表这五种比例的样品溶液，并使用0.2微米聚醚砜膜过滤器进行过滤除菌。将样品分装至2R玻璃小瓶中，每瓶1毫升。为了确保所有样品在后续冷冻过程中具有可比且均一的冰晶形态，从而排除冰晶界面差异对稳定性的干扰，研究团队采用了严格控制的冷冻程序：在冻干机中，以1 K/min的速率冷却至-5°C并保持60分钟，在此期间利用“LyoCon Ice Fog”技术进行受控成核，诱导均一的冰晶形成，然后再以1 K/min冷却至-40°C。完成初始冷冻后，样品被分别转移至预冷至-10°C、-20°C和-80°C的冰箱中进行长期储存。

其次，在稳定性分析环节，研究设置了多个时间点（初始T0、6周、6个月和12个月）对样品进行检测。每个时间点对每个配方取三个平行样品（n=3）进行分析。分析主要采用两种方法：（1）使用体积排阻色谱法 检测可溶性高分子量聚集体（HMWs）；（2）使用流动成像显微镜 计数粒径≥1微米的亚可见颗粒（SVPs）。这为评估单抗的物理稳定性（包括可溶性与不溶性聚集）提供了全面的数据。

第三，为了理解不同比例样品的稳定性差异背后的物理机制，研究团队开发了一种新颖的差示扫描量热法 测定样品Tg‘的方法。由于不含蔗糖等典型玻璃形成剂的纯蛋白/缓冲盐体系在DSC谱图中通常难以观察到清晰的玻璃化转变台阶，他们优化了样品前处理流程：首先将不同比例的样品进行冷冻干燥，然后用较少的水进行复溶，使最终蛋白浓度高达100 mg/mL。这种方法显著增强了DSC信号，使得所有样品都能获得清晰的S型热流曲线，从而可以直接通过曲线的拐点精确确定Tg‘值（通常报道的中点Tg‘）。这种方法的关键创新在于，通过冻干复溶提高了溶质浓度而不改变其比例，从而能够准确测量原本在低浓度下难以检测的Tg‘。

三、 研究的主要结果

1. 长期冻存稳定性结果：

   • -80°C储存： 在所有储存时间点（长达12个月），所有五种比例的样品中均未检测到HMWs的增加，SVPs的数量也保持在很低的初始水平，没有显著升高。这表明，在远低于样品Tg‘（约-31°C至-37°C）的-80°C下储存，分子运动被极大抑制，完全阻止了单抗的聚集和颗粒形成。
   • -20°C储存： 在-20°C（高于所有样品的Tg‘）储存6个月后，HMWs开始出现不同程度的增加，并在12个月后更为明显。有趣的是，HMWs的相对增加（百分比）在单抗浓度最低的样品中最高。相反，SVPs的绝对数量则在单抗绝对浓度最高的样品（最大单抗浓度和最大组氨酸浓度样品）中急剧增加，12个月后达到数十万至上百万颗粒/毫升，而单抗浓度较低的样品SVPs增长则少得多。
   • -10°C储存： 在更高的储存温度-10°C下，上述趋势被显著放大。6个月和12个月时，所有样品的HMWs和SVPs水平均远高于-20°C下的对应值。同样，HMWs的相对形成在低单抗浓度样品中最严重，而SVPs的绝对数量在高单抗浓度样品中暴增。值得注意的是，最小组氨酸比例的样品在所有温度下都表现出最高的整体稳定性（HMWs和SVPs均较低）。

2. 玻璃化转变温度测定结果： 通过优化的DSC方法，成功测得了所有样品的Tg‘。结果显示，Tg‘高度依赖于单抗与组氨酸的比例。最小组氨酸比例（即单抗比例最高）的样品Tg‘最高，约为-30.9°C。随着mAb:His比例向组氨酸偏移（即比例数值减小），Tg‘逐渐降低。初始比例样品的Tg‘为-35.3°C，而最大组氨酸比例样品的Tg‘最低，为-37.1°C。这一发现至关重要，因为它将配方组成（蛋白/缓冲盐比例）与一个关键的物理稳定性参数直接联系起来。

3. 结果的逻辑关系与对结论的贡献： 稳定性结果与Tg‘测定结果之间存在清晰的逻辑链条。首先，-80°C下的完美稳定性直接验证了“储存温度低于Tg‘可完全阻止降解”的理论。其次，在-20°C和-10°C（均高于Tg‘）下观察到的稳定性差异，可以部分归因于各样品Tg‘的不同。储存温度与Tg‘之间的差值（ΔT）越大，分子运动性越强，降解速度越快。因此，具有较高Tg‘（如最小组氨酸样品）的样品，其ΔT较小，表现出更好的稳定性。然而，单靠Tg‘差异无法完全解释所有现象，特别是HMWs与SVPs形成趋势的分离。这引入了另外两个关键因素：离子强度和绝对蛋白浓度。高组氨酸浓度（低mAb:His比）意味着冷冻浓缩基质中离子强度更高，可能通过增强蛋白质-蛋白质相互作用或蛋白质-冰界面相互作用而促进不稳定性。同时，高绝对蛋白浓度虽然降低了相对聚集百分比（HMWs），但由于蛋白质分子总数多，导致绝对颗粒数（SVPs）很高，这反映了蛋白质-蛋白质相互作用的浓度依赖性。低蛋白浓度样品则因界面吸附的相对比例更高，更容易形成可溶性聚集体（HMWs）。这些结果共同描绘了一个多维度的稳定性图景。

四、 研究的结论

本研究的核心结论是：在大规模冷冻单抗溶液过程中发生的冷冻浓缩现象，即使引起的浓度相对变化看似微小，也会通过改变单抗与缓冲盐的比例，对长期冻存稳定性产生显著影响。这种影响是Tg‘、冷冻浓缩基质中的离子强度以及绝对单抗浓度三者共同作用的复杂结果。

1. 储存温度是关键： 将冻存温度控制在所有区域样品Tg‘以下（本研究为-80°C），可以完全消除因冷冻浓缩不均一性带来的稳定性风险。
2. 冷冻浓缩的区域性影响： 当储存温度高于Tg‘时，容器内不同区域将面临不同的稳定性挑战。将小规模实验结果映射回2升瓶中的不同区域可知：(a) 高浓度区域（如瓶底中心和顶部）：倾向于形成大量的亚可见颗粒（SVPs）；(b) 低浓度区域（如容器的几何中心稀释核心）：更容易形成可溶性高分子量聚集体（HMWs）；© 缓冲盐浓度最低的区域（如瓶壁附近）：由于具有最高的Tg‘和最低的离子强度，展现出最佳的总体稳定性。
3. 配方与工艺启示： 为优化冻存稳定性，应考虑：(a) 通过优化配方（如避免使用导致低Tg‘的辅料）来最大化Tg‘，从而允许在较高温度（如-40°C）下安全储存；(b) 尽可能降低缓冲盐浓度以减少离子强度；© 提高初始蛋白浓度可能有助于降低相对聚集比例；(d) 通过调整冷冻速率或采用定向冷冻等工艺手段，可以减少冷冻浓缩的不均一性。

五、 研究的亮点

1. 研究视角新颖： 首次系统地将大规模冷冻过程中实际发生的、由冷冻浓缩导致的蛋白/辅料比例变化，与长期冻存稳定性直接关联起来，架起了工艺研究与制剂稳定性研究之间的桥梁。
2. 方法学创新： 开发了一种有效的DSC方法，用于精确测定不含典型玻璃形成剂（如糖类）的蛋白/缓冲盐体系的Tg‘，解决了该领域的一个技术难点。
3. 机制阐释深入： 不仅观察到了稳定性差异，还从Tg‘、离子强度和绝对蛋白浓度三个维度深入解释了HMWs和SVPs形成趋势分离的原因，提供了更全面的机理解释。
4. 实践指导性强： 研究结论对生物制药工业中单抗原料药的冷冻工艺开发、配方优化以及储存条件设定具有明确的指导价值，指出了潜在的风险区域和相应的控制策略。

六、 其他有价值的发现

研究还指出，未来值得探索的方向包括：系统研究单抗与缓冲盐浓度在不同配比下的稳定性规律；评估在略低于Tg‘的温度（如-40°C）下储存的可行性，以实现更可持续的低温储存；以及考察添加蔗糖等冷冻保护剂对缓解冷冻浓缩效应和提升稳定性的作用。此外，研究强调了在高于Tg‘温度下储存时，稳定性下降与ΔT呈正相关，为预测产品货架期提供了理论依据。