本研究的主要作者是曾超曦、齐穗健、辛瑞璞、杨波和王永华。曾超曦、齐穗健、辛瑞璞和王永华来自华南理工大学轻工与食品学院，杨波来自华南理工大学生物科学与工程学院。该研究于2015年7月26日在线发表于 Springer 旗下的学术期刊 Bioprocess and Biosystems Engineering 上，标题为“Enzymatic selective synthesis of 1,3-DAG based on deep eutectic solvent acting as substrate and solvent”。
这项研究属于生物工程与食品科学交叉领域，具体聚焦于酶催化合成功能性脂质。研究的学术背景在于，1,3-二酰基甘油（1,3-DAG）作为一种天然存在于食用油中的微量成分，已被证明在预防和管理人体与动物体脂积累方面具有显著效果，同时也是合成特定结构脂质不可或缺的前体物质。传统的1,3-DAG合成方法，特别是酶催化甘油与脂肪酸的酯化反应，面临着反应效率、产物选择性和使用有机溶剂带来的环境与安全问题。近年来，低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents, DESs）作为一种新型绿色溶剂受到广泛关注，它由特定摩尔比的氢键供体与氢键受体混合形成，具有价格低廉、毒性低、生物可降解等优点，在生物催化领域展现出应用潜力。特别的，有研究表明DESs不仅能作为反应介质，还可能改变其中组分的性质，甚至影响酶的活性和选择性。然而，在本研究之前，尚未有将DESs同时作为底物（甘油）的载体和反应溶剂用于酶促酯化合成特定甘油酯（如1,3-DAG）的报道。因此，本研究旨在探索基于DESs（由甘油与季铵盐化合物形成）作为底物和溶剂的酶促选择性酯化新体系，重点研究DESs对脂肪酶催化性能、反应选择性的影响，并建立高效合成1,3-DAG的新方法。研究目标包括：评估不同季铵盐（氯化胆碱ChCl和甜菜碱Betaine）对脂肪酶活性的影响；探究关键因素（如水含量、DESs种类、季铵盐比例）对酯化反应转化率和酶选择性的影响；并最终以ChCl-甘油DES体系为模型，优化1,3-DAG的合成条件。
该研究的工作流程主要包括以下几个环节： 第一，低共熔甘油混合物（EGMs）的制备。研究采用热混合法，将氯化胆碱（ChCl）或甜菜碱（Betaine）与甘油按特定摩尔比例（文中主要使用1:2的ChCl/甘油摩尔比）在80°C下剧烈搅拌2小时，形成均一的低共熔混合物。所有制备的EGMs通过卡尔·费休滴定法测定水含量，通常控制在0.5-1.0 wt%之间。这一步骤是构建整个反应体系的基础，其关键在于利用季铵盐与甘油之间的氢键作用形成具有新特性的溶剂环境。
第二，脂肪酶催化油酸与甘油的酯化反应。反应在50 mL锥形瓶中进行，置于旋转摇床（250 rpm）上。将油酸与上述制备的EGMs（其中已含有作为底物之一的甘油）按一定摩尔比例混合，加入脂肪酶后开始反应。在特定时间间隔取样，用正己烷和异丙醇的混合溶剂稀释并离心，上清液经滤膜过滤后用于高效液相色谱（HPLC）分析。此过程的关键变量包括：脂肪酶种类（Novozym 435， Lipozyme TL IM， Lipozyme RM IM， Lipase G50， Lipase F-AP）、DESs类型（ChCl/甘油或Betaine/甘油）、水添加量（0-5 wt%）、反应温度（50-65°C）、底物摩尔比（油酸/甘油）以及脱水方式（不加脱水剂、添加4Å分子筛、真空脱水）。研究并未开发全新的实验设备或算法，但创新性地将DESs（特别是ChCl/甘油体系）同时作为反应底物（甘油源）和溶剂，这是一种新颖的实验体系构建方法。
第三，反应产物组成的HPLC分析。采用正相高效液相色谱（NPHPLC）配备示差折光检测器进行分析。色谱柱为Phenomenex Luna柱，流动相为正己烷、异丙醇和甲酸的混合溶剂。通过对比标准品的保留时间来鉴定各组分：甘油三酯（TAG， 3.12 min）、油酸（3.76 min）、1,3-DAG（4.40 min）、1,2(2,3)-DAG（5.51 min）、1(3)-单酰基甘油（MAG， 22.14 min）和2-MAG（22.93 min）。产物中各酰基甘油组分和油酸的含量以峰面积百分比表示，并最终转化为摩尔百分比以便于数据展示和比较。数据分析基于三次独立实验的平均值，使用 Waters 2695 积分软件处理。
研究的主要结果如下： 首先，不同季铵盐添加体系中脂肪酶的性能评估。结果显示，在ChCl添加体系中，Novozym 435（N435）和Lipozyme RM IM（RM IM）表现出较高的活性，24小时后油酸转化率分别达到42.4%和较高水平；而其他测试的脂肪酶（TL IM， G50， F-AP）活性极低（≤5%）。与之形成鲜明对比的是，在甜菜碱（Betaine）添加体系中，所有五种测试的脂肪酶都能获得较高的油酸转化率。这表明甜菜碱由于其“相容性溶质”的特性，对酶活性的干扰较小，而ChCl中的氯离子可能对某些酶的活性有破坏作用。这一结果筛选出了适合DESs环境的高活性酶（N435和RM IM），并确定了两种季铵盐对酶活性影响的显著差异，为后续选择性研究奠定了基础。
其次，水添加量的影响。研究发现，水含量对反应的影响因酶和DESs体系而异。在甜菜碱体系中，使用N435催化时，随着水含量从0%增至4%，2小时时的油酸转化率从31.76%急剧下降至11.95%，这符合酯化反应平衡原理，水分不利于合成。但在ChCl体系中，N435催化的反应转化率随水含量变化不显著，且在2%水含量时转化率最高（2小时8.8%，6小时25.2%）。作者认为这是因为ChCl能与水形成更强的氢键，降低了体系中自由水的热力学活度。对于RM IM，在ChCl体系中，水含量低于1%时转化率极低，高于1%后则显著升高，表明该酶需要更多水来维持其催化构象。更重要的是，水含量影响了酶的选择性。在ChCl/N435体系中，随着水含量增加，DAG选择性和1,3-DAG选择性均逐渐下降，但仍保持在85%以上，表明该体系利于1,3-DAG积累。而在甜菜碱/RM IM体系中，水含量增加略微提高了DAG选择性，但1,3-DAG选择性基本不变。这部分结果揭示了水在DESs酶催化体系中的复杂角色，不仅是反应物或产物，还通过影响DESs的微观结构和酶的微水环境来调控反应进程和选择性。
第三，不同低共熔溶剂和反应时间的影响。比较了纯甘油体系、ChCl/甘油DES体系和甜菜碱/甘油DES体系在N435催化下的表现。油酸转化率在三者间无显著差异，但初始反应速率以甜菜碱体系最高，ChCl体系最低，然而ChCl体系最终能达到较高的转化率，说明质量传递并非限制因素，ChCl本身对反应有更深刻的影响。关键差异在于产物分布：在DAG选择性方面，ChCl体系远高于纯甘油和甜菜碱体系，且几乎不积累MAG；在1,3-DAG选择性方面，ChCl体系也显著高于另外两个体系。甜菜碱体系与纯甘油体系在选择性上表现相似。这表明ChCl能显著改变脂肪酶的催化选择性，而甜菜碱作为相容性溶质则基本不影响。作者推测ChCl可能通过其形成的强氢键网络环境，改变了酶活性中心的微环境或体系的水活度，从而改变了酶的 regioselectivity（区域选择性）。
第四，ChCl添加量的影响。研究了不同ChCl/甘油摩尔比（1:1， 1:1.5， 1:2， 1:2.5）对选择性的影响。随着ChCl比例的增加，DAG选择性和1,3-DAG选择性均逐渐提高，呈现剂量依赖性效应。这证实了ChCl是改变酶选择性和反应化学平衡的关键因素，其影响程度与其在体系中的浓度直接相关。作者进一步将此效应与溶剂极性联系起来，指出ChCl/甘油DES具有高极性（ET(30)值达58.58 kcal/mol），而高极性溶剂不利于酰基迁移的过渡态电荷分散，从而抑制了酰基迁移，使得最初生成的1,3-DAG得以保持，提高了1,3-DAG的选择性。
第五，1,3-DAG的酶法合成优化。基于以上发现，研究选择ChCl/甘油DES体系作为模型，优化1,3-DAG的合成。考察了底物摩尔比（油酸/甘油）、温度、脱水方式和酶用量等因素。结果表明，增加甘油比例（即降低油酸/甘油比）能缩短达到最高1,3-DAG含量所需的时间并提高其产率。在60°C下反应较为适宜。脱水方式（分子筛、真空或无脱水）对达到最高1,3-DAG含量所需时间影响不大，考虑到能耗，推荐不使用脱水剂的简化工艺。增加酶用量能显著提高反应速率，缩短达到产物峰值的时间。在最优条件下（ChCl/甘油摩尔比1:2， 油酸/甘油摩尔比1:4， 60°C， 12%酶负载，无脱水），反应仅1小时即可获得42.9 mol%（56.7 wt%）的1,3-DAG。这一结果在反应速度上优于许多已报道的采用有机溶剂（如正己烷、叔丁醇）或无溶剂但需真空脱水的体系，展示了该DES体系的效率优势。
本研究的结论是：由甘油与季铵盐化合物（ChCl或甜菜碱）形成的低共熔混合物（EGMs）可以成功用作酶促酯化反应中同时作为底物和溶剂的新型绿色体系。两种季铵盐体系均能显著改变脂肪酶的催化性能，但其影响方式不同。甜菜碱体系对酶活性更温和，而ChCl体系则能显著改变酶的选择性，特别是在提高DAG和1,3-DAG的选择性方面效果突出。研究阐明了水含量、季铵盐种类和比例等关键因素对反应的影响机制。最终，利用ChCl添加体系对Novozym 435催化选择性的提升作用，建立了一种快速、高效且环境友好的1,3-DAG合成新方法，在短时间内获得了高含量的1,3-DAG。
这项研究的价值体现在多个层面。在科学价值上，它首次系统地将DESs同时作为反应底物和溶剂用于酶促合成，拓展了DESs在生物催化中的应用范畴；深入揭示了DESs组成（特别是季铵盐类型和比例）以及水含量对酶活性、选择性和反应平衡的调控机制，为理解酶在非传统溶剂中的催化行为提供了新见解；明确了ChCl/甘油DES通过可能改变酶活性中心微环境、抑制酰基迁移等途径来提高1,3-DAG选择性的作用，丰富了溶剂工程调控酶选择性的理论。在应用价值上，它开发了一种无需有机溶剂、在温和条件下快速合成高附加值功能性脂质（1,3-DAG）的绿色工艺，具有工业化潜力；所使用的DESs组分（如ChCl、甘油）成本低、易得、生物相容性好，符合绿色化学和可持续发展理念。
本研究的亮点突出。第一，重要的发现：首次报道了ChCl/甘油DES能显著提高脂肪酶催化合成1,3-DAG的选择性和效率；明确了甜菜碱与ChCl在DESs中对酶活性影响的本质差异。第二，方法的创新性：创造性构建了以DESs同时作为底物和溶剂的“一石二鸟”型酶反应体系，避免了额外添加溶剂，简化了工艺。第三，研究对象的特殊性：聚焦于具有重要营养健康功能的结构脂质1,3-DAG的绿色合成，目标产物具有明确的市场应用前景。第四，系统性和机制探讨：不仅优化了工艺条件，还深入探究了水、季铵盐比例等因素的影响，并尝试从溶剂极性、氢键作用等角度解释现象，使研究兼具应用深度和理论高度。
其他有价值的内容还包括：研究中对多种商品化脂肪酶在DESs中的适应性进行了筛选，为后续相关研究选择酶催化剂提供了参考；通过对比不同脱水方式，提出了简化工艺（无需脱水）的可能性，进一步增强了该技术的经济性和可操作性；将DESs的特性（如固定自由水能力、高极性）与观察到的酶学现象（活性、选择性变化）进行了关联，为DESs在生物催化中的理性设计提供了思路。这项研究为功能性脂质的绿色生物制造开辟了一条富有前景的新途径。