作者Benjamin P. Kleinstiver、Michelle S. Prew、Shengdar Q. Tsai等来自麻省总医院分子病理学中心、哈佛医学院病理学系及Broad研究所等机构，联合完成了这项关于CRISPR-Cas9核酸酶PAM特异性改造的研究。该研究以“Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities”为题，于2015年7月23日发表在《Nature》杂志第523卷第7561期上。

研究背景

CRISPR-Cas9技术是目前应用最广泛的基因组编辑工具，其靶向识别依赖于向导RNA与靶序列的互补配对，同时还需要靶位点附近存在特定的前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）。最常用的化脓性链球菌Cas9（Streptococcus pyogenes Cas9，SpCas9）主要识别NGG PAM，这一限制使得许多需要精确定位的基因组编辑应用难以实现，例如同源定向修复（homology-directed repair，HDR）、在微小遗传元件中引入插入缺失突变（insertion or deletion，indel），以及等位基因特异性编辑等。此前有研究者尝试通过突变R1333和R1335残基来改变SpCas9的PAM特异性，但获得的R1333Q/R1335Q变体未能在体外切割含NAA PAM的靶点。本研究的目标是通过结构信息指导、细菌筛选和组合设计等手段，获得具有全新PAM识别特性的SpCas9变体，并验证这些变体在斑马鱼胚胎和人类细胞中的基因组编辑效率与特异性。

研究流程与实验方法

作者首先在人U2OS细胞系中利用EGFP报告基因破坏实验验证了R1333Q/R1335Q及单点突变体对NAA、NAG、NGA PAM靶点的切割效率，确认这些突变体无法有效切割预期靶点，提示需要引入额外突变。为此，作者构建了细菌正筛选系统，该系统利用Cas9对含诱导型毒性基因的选择质粒进行切割，使携带能识别特定PAM的Cas9变体的细菌存活。他们对野生型SpCas9和R1335Q变体的PAM相互作用结构域（PI结构域）进行随机突变，构建了复杂度超过10^7的突变文库，并用含NGA PAM的靶点进行筛选。通过对存活克隆的序列分析，作者发现高频突变主要为D1135V/Y/N/E、R1335Q和T1337R。随后他们将这些突变进行组合，在人细胞EGFP破坏实验中评估各组合对NGA与NGG PAM的区分能力，最终选择了D1135V/R1335Q/T1337R（VQR变体）和D1135E/R1335Q/T1337R（EQR变体）进行进一步鉴定。

为了确定这些SpCas9变体的全局PAM特异性，作者建立了一种基于细菌负筛选的位点耗竭实验（site-depletion assay）。在该实验中，他们构建了带有6个随机碱基对（位于protospacer 3’端）的质粒文库，将文库转化到表达Cas9/sgRNA的大肠杆菌中。若Cas9能识别某PAM并切割质粒，则该质粒因失去抗生素抗性基因而无法使细菌存活，从而从文库中被耗竭。通过比较筛选后与筛选前各PAM频率，计算post-selection PAM depletion value（PPDV）来估计Cas9对各PAM的活性。同时，利用催化失活的dCas9作为对照，确定了统计学显著耗竭阈值（PPDV低于0.85），并设定5倍耗竭（PPDV为0.2）作为可预测人细胞活性的生物学阈值。通过该实验，作者发现VQR变体主要识别NGAN PAM并对NGCG PAM也有一定活性，而EQR变体对NGAG PAM更具特异性。人细胞EGFP破坏实验的结果与PPDV数据高度一致，表明PPDV阈值能够较好预测人细胞编辑活性。

接下来，为获得识别NGC PAM的SpCas9变体，作者从预先携带R1335E/T1337R或R1335T/T1337R突变的突变文库中进行细菌正筛选。通过对存活克隆的突变组合分析和人细胞EGFP实验验证，作者获得了四突变变体D1135V/G1218R/R1335E/T1337R（VRER变体），该变体对NGCG PAM表现出高特异性。位点耗竭实验显示VRER变体仅对NGCG PAM有明显耗竭，人细胞实验也证实其主要切割NGCG PAM，而对NGCH和NGNG PAM活性很低。

为验证这些变体在真实内源基因位点的编辑能力，作者在斑马鱼胚胎和人类细胞中分别测试了VQR和VRER变体。在斑马鱼胚胎中，VQR变体能有效修饰含NGAG PAM的内源位点，突变率在20%到43%之间，而野生型SpCas9不能有效切割这些位点。在人类细胞中，VQR变体对多个含NGA PAM的内源位点也表现出6%到53%不等的编辑效率，且偏好顺序为NGAG>NGAT=NGAA。VRER变体在含NGCG PAM的人类内源位点上也表现出5%到36%的编辑效率。通过计算人类基因组中可靶向位点的数量，作者发现VQR和VRER变体使SpCas9的靶向范围扩大了一倍。同时，作者开发了在线工具CasBLASTR（http://www.casblastr.org）用于设计这些变体的sgRNA靶点。

为评估VQR和VRER变体的全基因组特异性，作者使用GUIDE-seq方法检测脱靶切割事件。结果显示，这些SpCas9变体检测到的脱靶双链断裂总数与野生型SpCas9相当，甚至VRER变体可能更好。脱靶位点大多带有预期的PAM序列，并且脱靶位点的错配特征与野生型SpCas9类似。

作者还注意到一个重要的意外发现：D1135E单突变体相比于野生型SpCas9更能区分NGG与NGA、NAG等非经典PAM。位点耗竭实验显示D1135E对NGA、NAG和NNGG PAM的活性降低，而人细胞EGFP破坏实验表明D1135E在经典NGG PAM位点的活性与野生型相当，但对非经典PAM的活性降低。为更直接评估D1135E对脱靶效应的影响，作者对三个sgRNA的25个已知脱靶位点进行靶向深度测序，结果显示在22个高于背景突变的脱靶位点中，D1135E在19个位点上相较于靶向位点具有更高的特异性。此外，GUIDE-seq实验也显示D1135E在全基因组范围内具有更好的特异性。

最后，作者研究了两个较小的Cas9直系同源物：嗜热链球菌Cas9（St1Cas9）和金黄色葡萄球菌Cas9（SaCas9）。他们利用位点耗竭实验确定了这两种Cas9的PAM特异性：St1Cas9识别两种新的PAM以及六种已知PAM；SaCas9在三次实验中均被耗竭超过5倍的PAM有NNGGGT、NNGAAT和NNGAGT。这两种Cas9也能在细菌正筛选系统中高效工作，说明它们可作为后续改造的候选对象。在人细胞中，St1Cas9在11个位点中有7个表现出1%到25%的编辑效率，SaCas9在16个位点中表现出1%到37%的编辑效率。

主要结论

本研究成功通过结构信息指导、细菌筛选和组合设计，获得了VQR和VRER两个具有改变PAM特异性的SpCas9变体。VQR变体识别NGAN PAM，VRER变体识别NGCG PAM，二者在斑马鱼胚胎和人类细胞中都能有效编辑此前野生型SpCas9无法靶向的位点，且其全基因组特异性与野生型SpCas9相当甚至更好。此外，D1135E单突变体在保持经典NGG PAM编辑活性的同时，显著降低了对非经典PAM的脱靶识别，从而提高了特异性。研究还证明St1Cas9和SaCas9能在细菌筛选系统和人类细胞中发挥作用，为对其他Cas9直系同源物进行PAM改造提供了基础。

研究亮点与价值

本研究的突出贡献在于系统性地建立了一套Cas9 PAM特异性改造与全局鉴定流程，包括细菌正筛选、位点耗竭分析以及人细胞功能验证。通过该流程获得的VQR和VRER变体显著扩展了SpCas9在基因组中的靶向范围，使更多基因组编辑应用成为可能。D1135E变体提供了一种简单有效的特异性改进方案，仅需单位点突变即可降低脱靶效应。此外，作者开发了CasBLASTR在线工具，方便研究者设计这些变体的sgRNA位点。所有新试剂均存入Addgene质粒库，便于科学界使用。该研究不仅提供了实用的SpCas9变体，更重要的是证明了改造多种Cas9以获得改变和改善PAM特异性的可行性，为后续更多Cas9变体的开发奠定了方法论基础。