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东亚及东南亚啮齿动物肺部病毒组解析：揭示东南亚大陆新发传染病的热点区域病毒多样性、进化模式与潜在人畜共患病风险
一、 研究团队、发表期刊及时间
本研究由一支国际研究团队合作完成。主要通讯作者是 Zhiqiang Wu（吴志强）和 Qi Jin（金奇），他们来自中国医学科学院 & 北京协和医学院病原生物学研究所，该研究所是国家卫生健康委员会（NHC）系统生物学重点实验室。第一作者由 Zhiqiang Wu， Yelin Han（韩叶林）和 Bo Liu（刘波）共同担任。研究团队还包括来自 EcoHealth Alliance、泰国孔敬大学和玛希隆大学、柬埔寨巴斯德研究所、老挝国立大学、云南省寄生虫病防治所以及多伦多大学等机构的科研人员。这项研究成果发表于期刊 Microbiome，在线发表日期为2021年。
二、 研究背景与目标
学术领域：本研究属于新发传染病、病毒生态学、宏转录组学和进化病毒学交叉领域。
研究背景与动机：人畜共患病毒病（如COVID-19、埃博拉）对人类健康构成重大威胁。啮齿动物是地球上种类最多、分布最广的哺乳动物类群，是众多重要人畜共患病毒（如汉坦病毒、沙粒病毒、肝炎病毒等）的天然储存宿主。东南亚地区因其丰富的生物多样性、哺乳动物（尤其是啮齿动物）的高度分化、野生动物消费传统以及快速的环境变化，被认定为新发传染病（Emerging Infectious Diseases, EIDs）的热点区域。然而，对该地区啮齿动物携带的病毒多样性，特别是其核心病毒组（core virome，指在宿主体内器官或组织中稳定存在的病毒群落）的系统性了解仍然有限。
先前的研究多集中在通过非侵入性采样（如咽拭子、肛拭子）分析动物口腔或肠道病毒组。这种方法虽然能捕获广泛的病毒信号，但无法有效区分哪些病毒真正感染了宿主动物，哪些只是环境中（如昆虫、植物）的病毒通过摄食等行为暂时存在。因此，针对宿主体内器官（如肺部）的“核心病毒组”分析，对于准确描绘自然宿主中的病毒感染状态、评估真实的人畜共患病风险至关重要。
研究目标：本研究旨在系统性地描述东南亚大陆（泰国、老挝、柬埔寨）啮齿动物及部分食虫动物肺部携带的病毒多样性。具体目标包括：1）利用宏转录组学技术全面调查该地区小型哺乳动物肺部的病毒群落谱；2）鉴定并表征新型病毒，特别是与已知病原体相关的病毒；3）分析这些病毒的生态分布（宿主物种、地理区域）和遗传进化特征；4）结合团队此前在中国的病毒组数据，为东亚和东南亚这一EID热点区域的野生动物和节肢动物媒介中的病毒群落提供更全面的认知基线，以期为未来新发传染病的早期预警和防控提供科学依据。
三、 详细研究流程与方法
本研究流程清晰，主要包括四个阶段：样本收集与处理、宏转录组测序与病毒序列鉴定、目标病毒的PCR验证与基因组测序、生物信息学与进化分析。
第一阶段：动物样本收集与处理（2006-2018年） 研究团队在泰国、老挝、柬埔寨三国的18个省进行了长达12年的系统性采样。共采集了3284只小型哺乳动物的肺组织样本。这些动物隶属于三个目：啮齿目（Rodentia，如鼠类）、攀鼩目（Scandentia，树鼩）和猬形目（Eulipotyphla，如鼩鼱、短尾毛猬）。样本涵盖了30个物种，其中优势物种包括小家鼠、多种家鼠属和板齿鼠属成员。采样点覆盖了城市、乡村和野生环境，确保了样本的生态代表性。捕获的动物经过人道处死后，立即采集肺组织，液氮暂存后转运至-80°C实验室冰箱长期保存。
第二阶段：宏转录组测序与病毒组概览 由于部分物种在同地点的重复采样，研究人员将3284个肺组织的总RNA样本按等量混合，最终构建了233个RNA池。为了富集病毒RNA，每个池的RNA先使用核糖体RNA去除试剂盒处理，然后构建RNA文库，利用Illumina HiSeq2500平台进行125bp双末端测序。总共获得了262.38 Gb的测序数据。 随后，进行生物信息学分析：1）使用BLASTX将测序reads比对到NCBI非冗余蛋白质数据库（NR）；2）过滤掉被归类为细菌、古菌、真核生物等细胞生物的reads以及无显著同源性的reads；3）将剩余的疑似病毒序列reads（共495，579条）根据其最佳匹配结果归类到已知的病毒科或未分类RNA病毒群。为了聚焦于哺乳动物相关病毒，研究人员进一步去除了非脊椎动物相关病毒和逆转录转座子相关的序列，最终获得了406,869条哺乳动物相关病毒reads，归属于24个已知的哺乳动物病毒科和一个未分类RNA病毒群。通过归一化处理（考虑病毒基因组大小和总测序reads比例），研究者绘制了热图，展示了不同病毒科在各物种和各省份样本池中的相对丰度和分布情况，初步勾勒出肺部病毒组的整体轮廓。
第三阶段：目标病毒的PCR验证与全基因组测序 基于宏转录组数据提供的线索，研究团队针对一些已知病原体相关或新型的病毒，设计特异性引物，回头对原始的个体肺样本进行PCR筛查。这步验证至关重要，它确认了病毒的普遍存在和宿主感染的真实性，并用于获取完整的病毒基因组信息。总计，他们从阳性样本中选取了216株代表性病毒进行全基因组或部分基因组的测序。这些病毒涵盖了多个重要的病毒类群，包括：汉坦病毒（Hantaviruses, HanVs）、白蛉病毒属病毒（Phleboviruses, PhleVs）、沙粒病毒（Arenaviruses, AreVs）、弹状病毒（Rhabdoviruses, RhaVs）、副粘病毒（Paramyxoviruses, ParaVs）、丙型肝炎病毒属病毒（Hepaciviruses）、戊型肝炎病毒（Hepatitis E Viruses, HEVs）、动脉炎病毒（Arteriviruses, ArteVs）、冠状病毒（Coronaviruses, CoVs）、小核糖核酸病毒（Picornaviruses, PicoVs）、星状病毒（Astroviruses, AstroVs）以及大量未分类的RNA病毒。基因组测序采用了包括重叠PCR、基因组步移、末端快速扩增（RACE）在内的多种技术来填补序列缺口。
第四阶段：生物信息学与进化分析 对于获得基因组序列的病毒，研究者进行了系统的生物信息学分析：1）基因组注释：使用ORF Finder预测开放阅读框，利用InterProScan预测保守结构域。2）序列比对与相似性分析：将新病毒序列与GenBank中的已知病毒序列进行比对，计算核苷酸和氨基酸序列一致性，评估其新颖性（相关数据以表格形式在Supplementary Information中提供）。3）系统发育分析：这是本研究的核心分析手段。针对每一类病毒，研究者下载了相关的参考序列，使用MUSCLE进行多序列比对，通过模型测试选择最佳替代模型，最后在MEGA6.0中使用最大似然法构建系统进化树，并进行1000次自举重复检验以评估节点的可靠性。这些进化树清晰地展示了新发现病毒在病毒进化树中的位置、与已知病毒的亲缘关系、是否形成新的进化支系，以及病毒进化与宿主物种、地理分布之间的关联模式。
四、 主要研究结果
结果1：肺部病毒组多样性全景图 宏转录组分析揭示，东南亚大陆啮齿动物肺部存在极其丰富的病毒多样性。检测到的病毒reads不仅来自汉坦病毒科、沙粒病毒科、动脉炎病毒科、黄病毒科（丙肝病毒属等）、疱疹病毒科、白蛉病毒科等广泛分布的病毒科，也零星检测到腺病毒科、星状病毒科、冠状病毒科、杯状病毒科、戊肝病毒科、副粘病毒科、小核糖核酸病毒科、布尼亚病毒科、弹状病毒科和呼肠孤病毒科等。尤为值得注意的是，有大量病毒序列无法归类到任何已知的病毒科，属于未分类的RNA病毒（属于核糖病毒域Riboviria），其序列与楚病毒科（Chuviridae）、野田村病毒科（Nodaviridae）或全病毒科（Totiviridae）等相关。这表明当前对啮齿动物病毒多样性的认知仍非常有限，存在大量“缺失的病毒”谱系。与之前口腔/直肠拭子的病毒组研究相比，肺部核心病毒组呈现出明显不同的特征：一些血液/体液传播的病毒（如白蛉病毒、丙肝病毒属病毒、动脉炎病毒）在肺部样本中广泛存在，而一些主要通过粪-口或呼吸道传播的病毒（如某些副粘病毒、戊肝病毒、轮状病毒等）则在肺部样本中较少或未检测到，反映了不同病毒的组织嗜性差异。
结果2：重要病原体相关病毒的详细表征 1. 汉坦病毒：在泰国的板齿鼠和两种家鼠属物种中鉴定出11株汉坦病毒。全基因组序列分析表明它们都属于“泰国病毒”（Thailand orthohantavirus）这一物种，与1994年和2004年在泰国报道的病毒株高度同源。系统发育分析将其归入鼠亚科相关的系统发育群III，形成一个独立的分支，与来自马达加斯加的Anjozorobe汉坦病毒关系较近。结果表明该病毒在泰国多个省份的鼠亚科动物中已持续循环数十年。 2. 沙粒病毒：发现了19株旧世界沙粒病毒，主要宿主为家鼠属。它们可分成两个不同的谱系：一个谱系与2008年在泰国黎府发现的黎府河病毒高度相似，在泰国5个省2010-2018年的样本中均有发现；另一个谱系与2009年在柬埔寨发现的豆蔻山病毒高度相似，主要见于柬埔寨西哈努克省。有趣的是，在泰国乌隆府的一只松鼠（Menetes berdmorei）中也检测到了属于柬埔寨谱系的病毒，这表明该病毒可能已扩散到更广的地理范围和新的宿主物种。 3. 白蛉病毒属病毒：鉴定出21株啮齿动物相关的白蛉病毒，宿主主要为家鼠属。这些病毒代表了两个新的病毒物种谱系：一个与乌库病毒相关，另一个与裂谷热病毒和Salehabad病毒相关。不同啮齿动物物种（如家鼠属、板齿鼠属、巢鼠属）中发现的病毒显示密切的遗传关系，提示可能存在跨物种传播或共同祖先。 4. 黄病毒科相关病毒：发现了51株丙型肝炎病毒属、Pegivirus属和瘟病毒属的病毒。系统发育分析显示它们形成了多个新的进化支系，并且多数病毒的进化关系与其啮齿动物或食虫动物宿主的系统发生关系高度一致，显示了明显的宿主特异性。研究首次在鼩鼱和树鼩中报道了丙肝病毒属和Pegivirus属病毒，扩展了这些病毒的已知宿主范围。 5. 动脉炎病毒：鉴定了49株动脉炎病毒。与之前在中国啮齿动物口肛样本中发现的、广泛散在分布于动脉炎病毒科各属的病毒不同，本研究在肺部发现的全部动脉炎病毒都聚集形成一个独立的进化支系，位于变动脉炎病毒亚科内，但不同于已知的β和γ动脉炎病毒属，并形成了与家鼠属、板齿鼠属等宿主相关的多个亚支系。这提示啮齿动物可能携带两种不同类型的动脉炎病毒，分别感染不同组织部位。 6. 冠状病毒：仅发现9株β冠状病毒，均属于乙型冠状病毒属（Embecovirus），未检测到α冠状病毒。这与之前在中国啮齿动物口咽样本中发现大量α和β冠状病毒的情况形成对比，暗示β冠状病毒感染可能主要发生在啮齿动物的上呼吸道，而α冠状病毒可能不感染其下呼吸道。 7. 其他病毒及未分类RNA病毒：研究还鉴定并描述了副粘病毒、弹状病毒、戊肝病毒、小核糖核酸病毒、星状病毒等多种病毒。特别重要的是，发现了28种高度多样化的未分类RNA病毒，其部分RdRp序列与已知病毒的同源性低于66.7%。系统发育分析显示它们形成了至少10个独特的进化谱系，其多样性谱与在无脊椎动物中观察到的RNA病毒谱相似，提示啮齿动物中RNA病毒的进化多样性比已知的更广，并且可能作为环境中某些节肢动物相关病毒的哺乳动物储存宿主。
五、 研究结论与价值
结论：本研究首次系统描绘了东南亚大陆啮齿动物及食虫动物肺部的核心病毒组，极大地扩展了我们对这一重要动物类群所携带病毒多样性的认知。研究发现：1）该地区啮齿动物肺部蕴藏着远超以往认知的病毒多样性，包括许多新型病毒和已知病毒的新宿主/新地理株系。2）家鼠属和板齿鼠属可能是该地区多种哺乳动物病毒的主要储存宿主。3）一些重要人畜共患病病原体（如泰国汉坦病毒、东南亚沙粒病毒谱系）在该地区持续循环，并显示出跨物种传播和地理扩散的潜力。4）啮齿动物肺部携带大量与节肢动物病毒亲缘关系较近的未分类RNA病毒，提示它们在虫媒病毒的自然循环和保存中可能扮演着复杂角色。
科学价值： 1. 基础病毒学与进化：提供了关于啮齿动物RNA病毒巨大多样性及其进化历史的宝贵数据，发现了多个新的病毒谱系，丰富了病毒分类学和进化树。 2. 病毒生态学：通过“核心病毒组”分析，更准确地揭示了病毒与自然宿主之间的真实感染关系，区分了组织嗜性差异，为理解病毒在生态系统中的分布和维持机制提供了新视角。 3. 新发传染病预警：在公认的EID热点区域建立了重要的病毒本底数据库。识别出潜在的病毒储存宿主（如特定的鼠属）、高风险病毒类群（如特定谱系的沙粒病毒、汉坦病毒）及其地理分布，为未来监测重点和目标提供了直接线索。 4. 公共卫生意义：研究强调了东南亚地区啮齿动物作为人畜共患病毒“蓄水池”的重要性，提醒公共卫生部门关注与啮齿动物密切接触（如农业活动、栖息地侵入）带来的疾病风险，并为跨国界、跨学科的联合监测与应对EIDs的努力提供了科学支撑。
六、 研究亮点
七、 其他有价值内容
本研究的数据共享做得非常到位。所有新测定的病毒基因组序列均已提交至GenBank（登录号MT085080-MT085341），宏转录组测序原始数据已存入NCBI BioProject（编号PRJNA605875）。此外，研究团队还提到了他们此前构建的在线病毒数据库（如dBatVir, dRodVir, dMosVir），鼓励数据整合与共享，这有助于推动更广泛的病毒发现与比较研究。文中也详细说明了动物伦理审批和采样许可，符合国际研究规范。最后，研究承认其样本在松鼠科、猬科等科的代表性有限，未来需要更广泛的采样以全面揭示该地区的病毒多样性。