关于抗体预制剂开发中相关振荡应力条件的研究报告

本研究由来自德国默克雪兰诺公司CMC开发部门的Annette Eppler、Markus Weigandt、Andrea Hanefeld以及来自布伦瑞克工业大学药物技术研究所的Heike Bunjes共同完成。研究成果以题为“Relevant shaking stress conditions for antibody preformulation development”的论文形式，发表于2010年的《European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics》期刊（第74卷，第139-147页）。

一、 学术背景 本研究隶属于生物制药领域，特别是蛋白质药物（尤其是单克隆抗体）的制剂开发与稳定性评估分支。随着生物制药的重要性日益凸显，抗体类药物在癌症、自身免疫性疾病等治疗领域取得了显著成功。然而，抗体的开发面临诸多挑战，其中物理不稳定性，特别是聚集（aggregation） ，是贯穿生产、储存和给药过程的一个关键问题。聚集可能导致药物活性降低甚至引发免疫反应。

在蛋白质制剂开发中，振荡应力（shaking stress） 测试被广泛用于快速评估制剂抵抗聚集的物理稳定性。该方法通过模拟运输、处理等过程中可能遇到的机械应力，加速潜在不稳定性的显现。然而，与光照稳定性测试（已有ICH指南）不同，当时并无针对振荡应力测试的标准化指南。因此，不同实验室采用的设计（如容器类型、填充度、振荡强度）差异很大，这导致了实验结果难以比较和解释，可能无法有效区分真正稳定的制剂与不稳定的制剂。

基于此背景，本研究旨在解决一个在预制剂（preformulation）早期开发阶段非常实际的问题：如何建立一个小规模、快速、且具有区分力（discriminatory） 的振荡应力测试方案。该方案应能在有限的蛋白样品量下，有效地区分“稳定性差”的缓冲液配方与“有进一步开发潜力”的稳定配方（通常指已上市或优化的处方）。研究的目标是系统性地评估不同实验参数（容器、填充度、振荡强度）对测试结果的影响，并最终确定一套最优化的条件。

二、 详细工作流程 本研究采用了系统性的实验设计，以不同的单克隆IgG抗体为模型蛋白，通过改变振荡应力参数，并综合运用多种分析技术来评估聚集情况。具体流程如下：

1. 研究材料与样品准备： * 研究客体： 使用了三种不同的单克隆IgG抗体（文中称为抗体A、B、C）。抗体A和B由默克雪兰诺提供，抗体C为已上市产品（罗氏公司）。这些抗体被配制成不同溶液进行研究。 * 样品类型： * “未制剂化”缓冲液： 将抗体A和B溶于简单的磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.2）中，浓度为2 mg/ml和5 mg/ml（例如A-PBS-2， B-PBS-5）。 * 已上市/优化制剂： 抗体A的已上市配方（A-MF-5，含柠檬酸盐缓冲液、甘氨酸、NaCl和聚山梨酯80，pH 5.5）和抗体C的已上市配方（C-MF-5，含PBS和聚山梨酯80，pH 6.9）。这些作为“稳定”的参考。 * 样品处理： 缓冲液配方用注射用水配制，调节pH后经0.2 μm滤膜过滤。使用不同类型的玻璃瓶（见表2），包括0.8 ml和1.5 ml HPLC小瓶、2 ml和6 ml注射用西林瓶。所有瓶子均经清洗、灭菌后，在无菌条件下灌装蛋白溶液并密封。每种条件设置三个平行样本。

2. 振荡应力实验设计： 研究系统地改变了三个关键参数： * 填充度（Filling Degree）： 在2 ml西林瓶中，分别填充0.5, 0.7, 1, 2, 3 ml的A-PBS-5溶液（对应不同顶空体积）。 * 容器类型与大小（Container Type and Size）： 使用0.8 ml, 1.5 ml, 2 ml, 6 ml四种容器，均填充其推荐体积的一半（分别为0.4, 0.75, 1, 3 ml），对A-PBS-2和B-PBS-2溶液在250 rpm下进行测试。 * 振荡强度（Shaking Intensity）： 在2 ml西林瓶（填充1 ml A-PBS-2溶液）条件下，测试150, 200, 250 rpm三种转速。 所有振荡实验均在水平线性振荡平台（振幅3 cm）上进行，温度控制在23±1°C。在预设时间点（0, 5, 24, 48, 120小时）取样分析，并设置未振荡的样品作为对照。

3. 分析检测方法： 为了全面评估不同尺寸和类型的聚集物，研究结合了三种分析方法： * 目视检查（Visual Inspection）： 直接观察样品的澄清度、乳光、颗粒和泡沫形成情况，并进行拍照记录。 * 浊度测量（Turbidity Measurements）： 使用紫外-可见分光光度计在350 nm波长下测量吸光度，作为检测大颗粒/沉淀物形成的替代方法（surrogate method） 。该方法所需样品量小，适用于早期开发。 * 体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC）： 用于定量检测可溶性单体蛋白的含量以及小分子可溶性聚集体（如二聚体、寡聚体）。样品在分析前经低速离心以去除可能堵塞色谱柱的大颗粒沉淀。

4. 辅助表征： * 测量了各配方的表面张力，以探讨表面活性剂（如聚山梨酯80）和蛋白浓度对界面性质的影响。 * 使用等电聚焦（IEF）测定了抗体的等电点。 * 在部分实验中，使用光学显微镜观察聚集体的形态。

5. 数据分析流程： 通过对比不同实验条件下，样品在目视外观、浊度值（OD350）和SEC单体含量随时间的变化趋势，来评估各参数的“应力强度”和“区分能力”。核心判断标准是：理想的应力条件应能在合理时间内（如数小时至数天） 导致不稳定配方（缓冲液）产生显著变化（浊度升高、单体减少），而对稳定配方（上市制剂）的影响较小，从而将两者清晰区分开来。

三、 主要结果 1. 填充度的影响： 使用A-PBS-5在2 ml瓶、200 rpm条件下测试。结果表明，填充度对蛋白稳定性有显著影响。填充1 ml（即推荐体积2 ml的一半）时，样品的浊度增加和SEC单体含量下降最为剧烈。填充量更少（0.5, 0.7 ml）或更多（2, 3 ml）时，不稳定性反而降低。这颠覆了“顶空越大，应力越强”的简单假设。作者推测，填充量过小时，液体体积不足以在瓶内产生充分的湍流；填充量过大时，液体运动缓慢，剪切力和界面更新频率降低。因此，中等填充度（约50%）产生了最剧烈的应力，这可能是剪切力与气-液界面效应共同作用的结果。

2. 容器类型与大小的影响： 在250 rpm下测试A-PBS-2和B-PBS-2。结果呈现复杂差异： * 6 ml瓶： 产生了大量泡沫，聚集体附着在气泡上并浮至液面，导致溶液本身浊度较低，但SEC显示单体损失明显。 * 2 ml瓶： 应力最为剧烈，样品在振荡初期（24小时内）浊度急剧上升，随后因形成大块沉淀上浮而变澄清，SEC单体含量迅速下降。 * 1.5 ml和0.8 ml小瓶： 产生了典型的较小蛋白聚集体，导致持续浊度。但0.8 ml小瓶的结果重复性差，同一组三个平行样品间差异巨大，表明在小容器内液体运动模式不可控、不一致。 * 不同抗体的行为： 在2 ml和6 ml瓶中，两种抗体的稳定性趋势相似；但在1.5 ml瓶中则显示出差异。 综合来看，2 ml注射用西林瓶（填充1 ml）在提供高强度、可重复应力方面表现最佳，且所需样品量适中，容器本身也适用于注射剂型。

3. 振荡强度的影响： 在2 ml瓶/1 ml填充条件下测试A-PBS-2。 * 150 rpm： 应力太弱，即使在120小时后也未引起明显的浊度增加或SEC单体下降。 * 250 rpm： 应力过于剧烈，导致快速形成大块沉淀和泡沫，样品在48小时后变澄清，SEC单体几乎检测不到。这种条件过于严苛，无法区分不同稳定性的配方。 * 200 rpm： 应力强度适中，浊度随时间持续稳定上升，SEC单体含量平稳下降，且未出现严重的泡沫或沉淀上浮干扰分析。此条件被确定为具有潜力的“区分性条件”。

4. 区分性条件的验证与普适性： 使用确定的“最佳条件”（2 ml瓶，1 ml填充，200 rpm）对比测试了“未制剂化”的A-PBS-5和“已上市”的A-MF-5。 * 结果： 两者表现出清晰差异。A-PBS-5在振荡5小时后浊度即显著上升，24小时后SEC单体含量开始明显下降。而A-MF-5在整个120小时测试期间保持澄清，SEC单体含量和聚集体含量均无显著变化。 * 对比过于剧烈的条件（250 rpm）： 在250 rpm下，两种配方均在短时间内发生剧烈变化，SEC单体含量迅速且同步下降，无法有效区分稳定与不稳定的配方。这证明了选择适度应力条件的重要性。 * 普适性验证： 使用该条件测试了另一种缓冲液配方B-PBS-5和另一种上市制剂C-MF-5。结果重现性良好：两种缓冲液配方表现出相似的不稳定趋势，而两种上市制剂均表现出优异的稳定性。这证实了该测试条件对于不同的IgG抗体具有可转移性（transferability）。

5. 表面活性剂的关键作用： 数据分析指出，已上市制剂（A-MF-5, C-MF-5）的优异稳定性主要归功于其中含有的表面活性剂聚山梨酯80（Tween 80）。测量显示，含Tween的配方表面张力（~43 mN/m）显著低于不含Tween的缓冲液配方（~56-67 mN/m）。Tween通过在气-液和固-液界面竞争性吸附，减少了蛋白质分子在界面的暴露和变性，从而有效抑制了由界面诱导的聚集。

四、 结论与意义 本研究得出结论：振荡应力测试的参数选择（容器、填充度、强度）对蛋白质聚集结果有巨大影响。不加以规范，不同实验室的结果将缺乏可比性，甚至可能误导制剂开发。

研究确立了一套适用于抗体预制剂开发阶段的小规模、快速、具有区分力的振荡应力测试方案：使用2 ml注射用西林瓶，填充1 ml蛋白溶液，在水平振荡平台（振幅3 cm）上以200 rpm的强度进行振荡，并通过目视、浊度测量和SEC进行综合分析。

该方案的科学价值在于首次系统性地量化并阐释了各物理参数对振荡诱导蛋白聚集的影响机制，强调了“适度应力”而非“最大应力”对于区分性测试的重要性。其应用价值非常直接：为工业界和学术界的蛋白质制剂科学家提供了一个标准化、可重复、且节省样品的预筛选工具，有助于在早期快速淘汰不稳定的候选配方，将资源集中于有潜力的配方上进行更深入的开发。同时，研究也提示，结合多种分析技术对于全面理解聚集现象（大小、类型）至关重要。

五、 研究亮点 1. 问题导向的实用性： 研究直接针对制剂开发实践中的一个空白——缺乏标准化振荡应力测试方法，目标明确，解决方案具体且易于实施。 2. 系统性的参数研究： 不是孤立地研究单个变量，而是将填充度、容器、强度三个关键参数联动考察，揭示了它们之间复杂的相互作用（如填充度与应力强度的非单调关系）。 3. “区分力”为核心的设计理念： 明确提出了振荡应力测试的目的不是“破坏”，而是“区分”。研究通过对比不稳定缓冲液与稳定上市制剂，成功找到了能实现这一目标的最佳平衡点。 4. 对传统观念的修正： 研究发现并论证了“最小填充量产生最大应力”这一常见观念并不总是正确，指出中等填充度可能因产生最大湍流而导致最强应力，深化了对机械应力机理的理解。 5. 方法学的严谨性： 采用多指标（外观、浊度、SEC）综合评价，并考虑了结果的重复性（排除了0.8 ml小瓶），最终方案建立在扎实的数据对比之上。

六、 其他有价值的发现 * 研究观察到，在过于剧烈的条件下（如250 rpm， 2 ml瓶），聚集物会形成大块沉淀并上浮或进入泡沫，这可能导致基于溶液的分析方法（如浊度）低估聚集程度，凸显了目视检查和多方法联用的必要性。 * 研究间接证实了表面活性剂（如Tween 80） 在保护蛋白质免受界面诱导聚集方面的关键作用，这为制剂处方开发提供了明确的指导。 * 尽管测试了三种不同的IgG抗体，但它们在所选定的优化条件下表现出相似的趋势，这初步表明该测试条件可能适用于更广泛的IgG类药物，为其普适性提供了早期证据。当然，作者也指出，仍需更多抗体数据进一步验证。