RNA干扰技术在甲壳类水产养殖中的应用综述

作者及发表信息
本文由Carlos Fajardo（西班牙卡迪斯大学海洋与环境科学学院）等来自多个国际研究机构的学者共同撰写，发表于2024年10月的期刊 *Biomolecules*（DOI: 10.3390/biom14111358），是一篇关于RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术在甲壳类（尤其是对虾）养殖中应用的系统性综述。

研究背景与目标
甲壳类水产养殖是全球增长最快的食品生产行业之一，但病毒性疾病（如白斑综合征病毒WSSV、黄头病毒YHV）和细菌感染（如弧菌病）导致严重经济损失。由于甲壳类缺乏适应性免疫系统，传统疫苗开发面临挑战。RNAi技术通过双链RNA（dsRNA）介导的基因沉默，能够特异性抑制病原体基因表达，为疾病防控提供了新思路。本文旨在总结RNAi的作用机制、设计方法、递送途径及在甲壳类养殖中的应用进展，并探讨规模化应用的瓶颈与解决方案。

主要内容与观点

1. RNAi的作用机制
   RNAi通过两步过程实现基因沉默：
   
   • 起始阶段：细胞质中的长链dsRNA（>100 bp）被Dicer2酶切割为21-22 bp的小干扰RNA（siRNA），其3’端带有两个核苷酸突出，可被RNAi系统识别。
     
   • 效应阶段：siRNA整合入RNA诱导沉默复合体（RISC），其中Argonaute（Ago）蛋白为核心组分。反义链引导RISC靶向降解同源mRNA，从而抑制基因表达。
     
   • 其他通路：除siRNA途径外，甲壳类还存在microRNA（miRNA）通路，通过Dicer1和Ago1调控转录水平基因沉默，影响宿主免疫应答（如凋亡、自噬）。
     

证据支持：
- 对虾（如凡纳滨对虾 *Penaeus vannamei*）中已鉴定出Dicer2、Ago2等关键蛋白，证实RNAi通路的存在。
- 实验显示，针对病毒基因（如WSSV的VP28或YHV的RdRP）的dsRNA可显著提高宿主存活率（如WSSV感染后存活率从0%提升至70%）。

1. RNAi在抗病毒与抗细菌感染中的应用
   
   • 抗病毒：靶向病毒非结构基因（如蛋白酶、RNA聚合酶）的dsRNA比结构基因更有效。例如，针对WSSV的RR2基因的dsRNA可提供88%保护率。
     
   • 抗细菌：沉默宿主基因（如调控抗氧化反应的 *pvdj-1*）可增强对弧菌（ *Vibrio alginolyticus*）的抵抗力，死亡率降低50%。
     
   • 抗寄生虫：针对微孢子虫（ *Enterocytozoon hepatopenaei*）的极丝蛋白基因（ *ehptp2*）的dsRNA可减少病原体传播。
     

局限性：非特异性dsRNA（如GFP序列）可能通过激活先天免疫提供短期保护，但特异性dsRNA对高病毒载量的防控更有效。

1. dsRNA的设计与合成挑战

   • 长度依赖性：长链dsRNA（>50 bp）比siRNA更有效，因其可被切割为多个siRNA，增强沉默效果。
     
   • 递送障碍：dsRNA易被消化酶降解，且细胞摄取依赖跨膜蛋白Sid-1或内吞作用。
     
   • 规模化生产：目前主要依赖大肠杆菌（如RNase III缺陷型HT115）或微藻（如 *Chlamydomonas reinhardtii*）表达dsRNA，但成本与安全性需优化。
     

2. 递送技术的创新

   • 口服递送：
     
     • 细菌载体：甲醛灭活的表达VP28-dsRNA的 E. coli 可提高对虾存活率（如WSSV感染后死亡率从100%降至35%）。
       
     • 微藻平台：转基因 C. reinhardtii 表达YHV-RdRP-dsRNA，使感染率从100%降至55.6%。
       
   • 纳米载体：
     
     • 壳聚糖纳米颗粒：包裹VP28-dsRNA后，保护效果可持续3周（存活率50%）。
       
     • 脂质体：阳离子脂质体包裹dsRNA可将有效剂量降低至0.05 µg/g（裸dsRNA需1.25 µg/g）。
       

意义与价值
本文系统梳理了RNAi技术在甲壳类养殖中的研究进展，为抗病毒策略提供了理论依据与技术路线。其科学价值在于阐明RNAi在无脊椎动物免疫中的独特机制，应用价值则体现在开发低成本、可规模化的dsRNA递送系统（如微藻表达、纳米载体），推动水产养殖业的可持续发展。

亮点
- 首次比较了siRNA与miRNA通路在甲壳类抗病毒免疫中的协同作用。
- 提出微藻递送dsRNA的环保方案，避免抗生素耐药基因扩散风险。
- 揭示同时沉默宿主（如 rab7 ）与病原体基因的多价保护效应。

未来方向
需进一步优化dsRNA稳定性（如修饰核苷酸）、开发靶向递送系统（如组织特异性载体），并评估长期使用对生态的影响。