本研究由楚乔亮（Chu-qiao Liang）、王琳（Lin Wang）、罗蕴怡（Yun-yi Luo）、李倩倩（Qian-qian Li）和李艳梅（Yan-mei Li）等人完成，主要作者来自清华大学化学系生物有机磷化学与化学生物学教育部重点实验室（Key Lab of Bioorganic Phosphorus Chemistry & Chemical Biology, Department of Chemistry, Tsinghua University），以及清华大学合成与系统生物学中心（Center for Synthetic and System Biology）和北京脑疾病研究所（Beijing Institute for Brain Disorders）。该论文于2021年发表在《Chemical Communications》期刊上，题为《Capturing protein droplets: label-free visualization and detection of protein liquid–liquid phase separation with an aggregation-induced emission fluorogen》。
本研究所属的科学领域是化学生物学与蛋白质生物物理学，具体聚焦于蛋白质液-液相分离（liquid–liquid phase separation, LLPS）的可视化与物理性质表征。蛋白质液-液相分离是细胞内无膜细胞器（membrane-less organelles, MLOs）形成的重要机制，与应激颗粒、中心体、异染色质等亚细胞结构的形成密切相关。此外，越来越多的证据表明LLPS及MLOs在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）和肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）等年龄相关神经退行性疾病中发挥关键作用。传统的LLPS检测方法包括浊度测定、共聚焦显微镜成像、光漂白后荧光恢复（fluorescence redistribution after photobleaching, FRAP）以及液滴融合延时成像等。然而，共聚焦显微镜研究通常需要对蛋白质进行荧光标记，例如使用增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）标签，但这种标签可能对蛋白质本身的结构和LLPS行为产生未知且存在争议的影响。化学荧光分子共价标记方法需要后处理过程，不适用于不稳定蛋白。已有的非共价分子如硫黄素T（ThT）、硫黄素S（ThS）和1,6-己二醇等虽然可用于LLPS成像与检测，但并不适用于所有LLPS体系。此外，传统荧光蛋白在连续成像时容易发生光漂白。除了可视化之外，液滴物理性质的进一步探索也具有重要意义。此前研究主要通过逆毛细管速度伴随被动微流变学或FRAP来检测蛋白液滴的粘度，但这些方法可能受实验设计影响，且FRAP的粘度是间接推导的，灵敏度较低。因此，开发一种更稳定、简单且可靠的LLPS检测、可视化和粘度表征方法具有迫切需求。
本研究的工作流程主要包括以下几个步骤。首先，研究者提出利用基于聚集诱导发光（aggregation-induced emission, AIE）的荧光分子——1,2-双[4-(3-磺酸丙氧基)苯基]-1,2-二苯基乙烯钠盐（BSPOTPE）作为液滴探针（DroProbe），用于蛋白质LLPS的无标记可视化。AIE荧光分子在完全溶解时不发光，但在聚集或分子内运动受限时会发出荧光，这一特性使其能够在蛋白质凝聚相中产生荧光信号。研究者在实验室中验证了三种蛋白质的相分离行为：U1-70K LC2结构域（317-407位氨基酸）、人tau441（1-441，htau441）和TDP-43（287-414）。这些蛋白质分别用EGFP或荧光素（fluorescein）标记，并在各自相分离缓冲条件下观察到液滴形成。随后，研究者建立了DroProbe非共价荧光标记的共聚焦成像方法，将相同浓度的蛋白质与20微摩尔DroProbe孵育，在共聚焦显微镜下观察到LC2、TDP-43和htau441的液滴荧光。为了进一步验证DroProbe能否捕获所有蛋白液滴，研究者将DroProbe加入EGFP或荧光素标记的蛋白质LLPS体系中，发现标记蛋白的绿色荧光与DroProbe的蓝色荧光完全重叠，且荧光强度边界一致，表明DroProbe能够准确标记蛋白液滴。此外，通过加入DroProbe作为探针，研究者还观察到了无标记htau441液滴的融合与运动行为，相邻液滴的融合过程约在30秒内完成。
在体外试管实验中，研究者利用DroProbe作为传感器观察到了htau441均相溶液与LLPS状态之间的明显荧光差异。均相溶液在紫外光下几乎无荧光且透明，而LLPS体系则呈现浑浊和荧光。显微镜CCD成像进一步证实了LLPS体系中液滴的形成，而在均相溶液中未观察到液滴。浊度测定结果也支持这一差异。此外，在DroProbe的最优发射波长470纳米处，LLPS体系的荧光强度相比均相蛋白溶液增加了2.2倍。
在物理性质研究方面，研究者利用DroProbe进一步探索了LLPS凝聚相的性质。通过FRAP实验发现，随着孵育时间延长，htau441液滴中荧光漂白后的不可移动部分增加且恢复时间延长，表明液滴流动性随时间降低，tau蛋白倾向于向固态聚集体转化。DroProbe标记的液滴在相同时间点也表现出类似的恢复趋势。更重要的是，DroProbe表现出比荧光素更好的光稳定性：在20个连续漂白循环（50秒）中，DroProbe的信号损失为60%，而荧光素的信号损失接近90%。
粘度是蛋白液滴的重要物理性质，与LLPS的功能密切相关。研究者利用荧光寿命成像显微镜（fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM）和荧光寿命光谱法（fluorescence lifetime spectrometry）探测了htau441液滴的粘度。此前研究表明，四苯乙烯（tetraphenylene, TPE）衍生分子的荧光寿命与环境粘度存在关系。研究者制备了不同体积分数的甘油和乙醇混合物，其粘度随甘油比例增加而增大，并测量了DroProbe在不同粘度溶剂中的荧光寿命，发现荧光寿命随粘度增加而逐渐延长。基于这一原理，研究者评估了不同盐浓度下tau蛋白液滴的粘度。研究者分别制备了含15毫摩尔NaCl、150毫摩尔NaCl和250毫摩尔NaCl的htau441 LLPS体系，并随机选取每个荧光寿命图像中的五个感兴趣区域（regions of interest, ROIs），测得平均荧光寿命分别为4.19纳秒、4.5纳秒和4.62纳秒。当盐浓度从15毫摩尔增加到150毫摩尔时，荧光寿命出现显著差异。荧光寿命分布也显示低盐浓度下的LLPS液滴具有更短的荧光寿命。整体荧光寿命光谱结果与上述结果一致。此外，FRAP实验表明，随着NaCl浓度增加，液滴的荧光恢复时间延长。这些结果表明，较高的盐浓度下htau441液滴具有更高的粘度，这可能是由于较高的离子强度促进了蛋白质分子间或分子内的多价相互作用，从而改变了液滴内部粘度。研究还发现，htau441液滴在15毫摩尔NaCl条件下孵育24小时后，粘度也随时间增加。
在分子机制探索方面，研究者发现DroProbe的存在对新鲜htau441 LLPS的浊度没有影响，但孵育24小时后观察到液滴形态出现一定程度的扭曲。通过测量httau441在LLPS条件下的自发荧光，研究者发现加入DroProbe后，htau441自发荧光的最优发射波长发生蓝移，表明htau441中的5个色氨酸残基被置于更疏水的环境中。此外，热熔解温度（melting temperature, Tm）的降低也表明DroProbe与htau441之间存在相互作用。由于蛋白质在凝聚相中高度浓集，DroProbe在液滴内也相应浓集，浓度效应和粘度效应共同贡献了荧光增强。
本研究的结论是：首次证明AIE衍生分子DroProbe能够在体外捕获蛋白液滴，并作为灵敏的粘度传感器。不同盐浓度下htau441 LLPS粘度差异的结果表明，较高的离子强度促进了蛋白质之间的多价相互作用。由于AIE分子具有可变性和良好的生物相容性，该工作为未来开发具有细胞应用和特异性识别功能的LLPS探针提供了新思路。该研究还拓展了AIE发光剂的应用，并有望在未来应用于治疗筛选平台。
本研究的亮点包括：首次将AIE基荧光分子DroProbe用于无标记蛋白质液滴的可视化和检测，避免了传统荧光蛋白标签对蛋白质LLPS行为的潜在干扰；利用DroProbe的荧光寿命作为粘度传感器，实现了蛋白液滴粘度的简单比较，克服了传统粘度测量方法的复杂性和不确定性；DroProbe具有优于荧光素的光稳定性，适合长时间连续成像；该探针为通用型工具，可适用于多种蛋白质LLPS体系，并可用于监测液滴融合和运动等动态过程。此外，研究还揭示了盐浓度对tau蛋白液滴粘度的调控作用，为理解LLPS物理性质的环境依赖性提供了新的实验依据。