本研究由日本佐贺医科大学生物化学系的心内科团队主导，主要作者包括Hidenobu Soejima、Shoko Kawamoto、Jun Akai等人，论文发表于2001年的 Genomics 期刊（第74卷，第115–120页）。该研究利用BodyMap基因表达数据库成功分离并鉴定了两个在心脏中优势表达的新基因——C3orf3和MMGL，并对它们的基因组结构、染色体定位、表达谱及亚细胞定位进行了系统分析。

从学术背景来看，该研究属于人类基因组学与心血管分子生物学交叉领域。尽管人类基因组计划已经公布了基因组草稿，但基因组序列的完成并不等于所有人类基因的识别。不同基因预测程序对基因数量的估计差异很大，从不足30,000到超过150,000个不等。因此，基于信使RNA（messenger RNA，mRNA）表达信息的基因鉴定方法在当时仍然被认为是一种可靠且有效的策略。BodyMap数据库正是一个基于非偏倚互补DNA（cDNA）文库中定向3′表达序列标签（3′-ESTs）的人类和小鼠基因表达数据库。该数据库收录了来自60种人类组织和38种小鼠组织的超过270,000条序列，每条序列平均长度为270个碱基对。该数据库可以用于估算组织中的mRNA组成、检索特定基因、筛选具有特定表达模式的基因，并可结合辐射杂交（radiation hybrid，RH）作图方法确定染色体定位。由于扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）的许多致病基因仍未被识别，作者希望通过BodyMap筛选心脏特异性转录本，进而定位到已知心肌病候选基因座，寻找新的候选致病基因。

在具体研究流程方面，作者首先从BodyMap数据库中筛选出21个仅在心肌中表达的新转录本，每个转录本都被赋予一个基因签名（gene signature，GS）编号。随后，利用Genebridge 4辐射杂交板对这些GS进行染色体定位，并将其与已知的心肌病候选基因座进行比对。结果发现，其中5个GS定位于心肌病相关的候选基因座。接下来，作者通过筛选人心脏cDNA文库以及5′-cDNA末端快速扩增（5′-RACE）技术获取了这些转录本的全长cDNA，并进行序列测定。测序结果显示，在这5个转录本中，有3个分别是已知基因——6-磷酸果糖-2-激酶基因（PFKFB2）、人ether-a-go-go相关基因（HERG）和人inactivation no after-potential D（INAD）样蛋白基因——的新的3′端可变转录本。其余两个转录本GS 14467和GS 13556被认为是新基因，并被进一步研究。由于当时在Ensembl数据库中尚无这两个转录本对应的基因组序列，作者通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）筛选了Incyte Genomics的人细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）文库，分别获得了包含这两个基因的BAC克隆。

对于GS 14467，研究获得了全长1677 bp的cDNA，编码504个氨基酸。对BAC克隆51H07的测序显示，该基因由12个外显子组成，跨度约10 kb。通过RH作图将该基因定位于3p1–p2，进一步通过荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）将其精细定位于3p22。该基因随后被人类基因命名委员会命名为C3orf3。Northern印迹分析显示，C3orf3在心脏和骨骼肌中强烈表达，在脑中微弱表达。其主要转录本为1.95 kb的条带，与获得的cDNA大小相符。该基因在胎儿心脏以及成体心脏的各部位（除主动脉外）均有表达，且各部位表达水平相近。BLAST搜索显示，C3orf3的3′端约1000 bp与已知的KIAA1173具有完全同源性，但C3orf3蛋白在N端比KIAA1173长172个氨基酸，提示C3orf3为全长序列。SOSUI程序预测C3orf3为具有七次跨膜螺旋的整合膜蛋白；而PSORTII程序预测其定位于内质网和质膜。通过构建C3orf3与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的融合蛋白并在小鼠心肌细胞系HM-K中表达，研究观察到该蛋白主要分布于细胞质，尤其是内质网丰富的核周区域，细胞核中信号较弱。

对于GS 13556，研究分离到了4种不同长度的cDNA变体，分别为4142 bp、894 bp、1209 bp和1315 bp，并将其命名为变体1至变体4。序列分析表明，这些变体是同一基因可变剪接的产物。研究人员通过PCR筛选获得了三个相互重叠的BAC克隆——277N18、65G12和09A08，并通过测序、Southern印迹和PCR分析确定了该基因的基因组结构。结果显示，该基因至少含有8个外显子，跨度超过70 kb。Northern印迹分析显示，该基因在心脏和骨骼肌中表达强烈，表现为1.0至1.3 kb的宽条带以及4.4和8.5 kb的额外条带，在脑和胎盘中也有微弱表达。4.4 kb条带在所有心脏部位均可检测到，而1.0至1.3 kb条带则仅在前述心脏部位可见，主动脉中只检测到4.4 kb条带。通过与各变体cDNA长度的比对，研究认为1.0至1.3 kb的条带对应变体2至4，4.4 kb的条带对应变体1，而8.5 kb的条带未获得相应cDNA。由于变体1的3′非翻译区中可能存在多个poly(A)信号，因此可能还存在未被Northern印迹检测到的其他3′端可变转录本。从蛋白编码能力来看，变体1和变体2均编码174个氨基酸；变体3编码的蛋白在C端少一个氨基酸残基；变体4则编码一个N端延长了66个氨基酸的240个氨基酸蛋白。BLAST搜索发现，GS 13556的cDNA与大鼠myomegalin具有高度同源性，因此将该基因命名为MMGL（myomegalin-like）。大鼠myomegalin是一个编码2324个氨基酸的大蛋白，被预测为环核苷酸磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）的相互作用蛋白。PDE通过降解环磷酸腺苷（cAMP）和环磷酸鸟苷（cGMP）在细胞信号转导中发挥关键作用。不过，由于MMGL与rat myomegalin的同源区域仅限于N端约500 bp或170个氨基酸，而且该区域未预测到已知功能域，因此尚无法判断MMGL是否也参与PDE介导的信号转导。PSORTII程序预测MMGL蛋白主要定位于细胞核（可信度为60.9%），但GFP融合蛋白实验显示MMGL变体1和变体4均分布于细胞质和细胞核中。在染色体定位方面，MMGL通过RH作图被定位于1q1，并通过FISH在1q1和1p1均检测到信号。作者认为1q1是正确的定位，因为RH作图使用的是MMGL的唯一序列。1q1曾经被认为是扩张型心肌病的一个候选基因座CMD1A，但后来由于发现LMNA基因（编码核纤层蛋白A/C）突变可导致DCM，该基因座被重新定位至1q21.2，因此作者未对MMGL进行DCM患者的突变筛查。对于C3orf3，尽管其位于DCM候选基因座CMD1E（3p22），作者在58例DCM患者（25例家族性和23例散发性）中进行了突变搜索，但未发现疾病特异性突变，仅发现5个单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms，SNPs），且这些SNPs与DCM易感性无关。

本研究的结论强调了BodyMap数据库在组织特异性基因分离中的实用性。尽管通过该数据库筛选出的C3orf3和MMGL在Northern印迹中显示出在心脏和骨骼肌中的强表达以及在其他组织中的微弱表达，与数据库中“心脏特异性”的原始判断存在一定差异，但作者解释了这种差异的原因。一方面，这些GS转录本可能是心脏特异性的3′端可变剪接产物，而使用全长cDNA或编码区探针进行Northern印迹会掩盖这种特异性；另一方面，其他组织中由于测序克隆数不足，GS转录本可能未被检测到。总体而言，该研究不仅提供了两个新基因的完整cDNA序列、基因组结构、表达特征和亚细胞定位，还展示了BodyMap在基于基因座的候选基因筛选中的应用潜力。虽然这两个基因最终未被证实为DCM的致病基因，但它们可能在心脏功能或心脏发育中发挥一定作用。未来通过特异性抗体进行免疫组织化学分析，或鉴定与这些基因产物相互作用的因子，将有助于揭示其具体功能。

本研究的亮点在于：第一，首次报道了C3orf3和MMGL这两个在心脏中优势表达的新基因，并提供了它们的全长cDNA、基因组结构和染色体定位；第二，展示了BodyMap这一基于3′-EST的基因表达数据库在组织特异性基因发现和疾病候选基因筛选中的可操作性；第三，结合了RH作图、FISH、Northern印迹、cDNA文库筛选、RACE、GFP融合蛋白定位等多种技术，形成了一个从生物信息学筛选到实验验证的完整研究流程。此外，研究还涉及对可变剪接的深入分析，揭示了MMGL至少存在四种不同的转录本变体，为后续功能研究提供了丰富的素材。