在新冠大流行期间，以BNT162b2和mRNA-1273为代表的mRNA疫苗以前所未有的速度在全球范围内得到部署和应用。然而，尽管这些治疗性mRNA的应用取得了巨大成功，人们对它们进入体内后的代谢命运，特别是其稳定性、降解和潜在调控机制却知之甚少。传统的认知范式推断，治疗性mRNA的稳定性主要由其3’端poly(A)尾的缩短速率，即去腺苷化所决定。但这一观点主要基于对内源性转录本的研究，对于封装在脂质纳米颗粒中、携带化学修饰的治疗性mRNA在体内复杂生理环境，尤其是免疫细胞中的代谢过程，仍是一个黑箱。本研究旨在填补这一知识空白，利用创新的纳米孔直接RNA测序等技术，首次在单分子水平上描绘了治疗性mRNA，特别是其poly(A)尾在体内的动态变化，并揭示了一个全新的调控机制：由内源性胞质聚腺苷酸聚合酶TENT5A介导的“再腺苷化”过程，这一过程能显著稳定mRNA，并增强疫苗的免疫原性，为提高未来mRNA疗法的效力指明了方向。
本研究主要由波兰华沙国际分子与细胞生物学研究所RNA生物学实验室的Pawel S. Krawczyk、Seweryn Mroczek及Andrzej Dziembowski等领衔的跨国团队完成，研究论文于2025年4月16日在线发表在顶级学术期刊《Nature》上。
研究背景与目的
mRNA技术作为疫苗设计手段是全新的领域。两种主要的COVID-19 mRNA疫苗——辉瑞/BioNTech的BNT162b2和Moderna的mRNA-1273——虽然在整体设计上相似，但在5’帽结构、非翻译区序列和3’尾结构上存在差异。例如，BNT162b2使用共转录的CleanCap AG帽1类似物，并具有30个腺苷酸-10个其他核苷酸-70个腺苷酸的复合poly(A)尾；而mRNA-1273采用转录后酶法加帽形成天然帽1，其poly(A)尾长度此前未公开。肌肉注射的mRNA疫苗主要被局部驻留和浸润的免疫细胞摄取，特别是巨噬细胞和树突状细胞。过去的研究多聚焦于树突状细胞，而作为摄取mRNA主要细胞类型的巨噬细胞却关注较少。研究团队的核心目标是：1. 解析治疗性mRNA在体内外的代谢，尤其是poly(A)尾的动态；2. 探究影响mRNA稳定性和疫苗效力的关键细胞机制；3. 为下一代mRNA疗法的优化提供原理性指导。
详细研究流程与结果
第一阶段：利用纳米孔测序解析mRNA疫苗的初始结构 研究团队首先面临方法论挑战。常规的基于cDNA扩增的测序方法在研究poly(A)尾这种同聚物序列时，易因聚合酶滑动而产生误差。因此，他们采用了牛津纳米孔技术的直接RNA测序。这项技术通过记录单个RNA分子穿过蛋白孔时引起的电流变化，提供单分子分辨率的RNA组成信息。然而，他们发现mRNA疫苗中的尿苷被N1-甲基假尿苷取代，会影响电流信号的解读。为此，团队开发了一种创新的子序列动态时间规整方法，成功识别出比标准流程多一倍的序列。对mRNA-1273疫苗的分析揭示，其最初含有一个约100个核苷酸长的poly(A)尾，末端紧接着一个独特的“mΨCmΨAG”五核苷酸序列（来源于DNA模板的限制性酶切残留）。这一发现至关重要，因为它为区分完整的疫苗mRNA（保留此五聚体）和已被加工的mRNA（已去除此五聚体）提供了分子标记，从而能够精确追踪poly(A)尾的后续代谢事件。相比之下，对BNT162b2的分析确认了其已知的复合poly(A)尾结构。
第二阶段：探究mRNA-1273在常规细胞系中的代谢——去腺苷化主导降解 为了在可控环境中研究mRNA代谢，团队首先在常用的HEK293T和A549细胞系中进行了时间进程实验。结果发现，mRNA-1273在这些细胞中经历了快速的降解。这一过程始于3’末端mΨCmΨAG序列的去除，随后，主要的去腺苷酶复合体CCR4-NOT介导了poly(A)尾的缩短。通过构建可诱导敲低CCR4-NOT复合体支架亚基CNOT1的细胞系，他们证实了抑制CCR4-NOT能显著减缓mRNA-1273的poly(A)尾缩短，表明去腺苷化是模型细胞系中限制治疗性mRNA寿命的关键步骤。同时，研究发现BNT162b2在细胞中显示出比mRNA-1273更慢的抗原产生动力学和去腺苷化速率。
第三阶段：在体及巨噬细胞模型中意外发现“再腺苷化”现象 当研究转向更具医学相关性的小鼠体内模型时，情况发生了戏剧性变化。研究团队将mRNA-1273肌肉注射到小鼠体内，并在不同时间点从注射部位和引流淋巴结分离RNA进行分析。定量PCR显示，注射部位的疫苗mRNA丰度远高于淋巴结。对注射部位RNA的纳米孔测序分析揭示，大多数mRNA-1273分子在注射24小时后仍保有未加工的末端mΨCmΨAG序列。然而，关键发现是：在注射24小时后，缺乏mΨCmΨAG的疫苗mRNA的poly(A)尾中位长度从100个腺苷酸增加到了114个，甚至有部分尾长延伸至高达200个腺苷酸。这表明在体内发生了poly(A)尾的延伸，即“再腺苷化”。
通过对免疫细胞浸润的分析，他们发现注射后24-48小时，肌肉部位主要由表达F4/80+CD64+CD11c+的巨噬细胞型细胞占据，而树突状细胞数量较少。分别对分选出的巨噬细胞和树突状细胞进行分析，发现两者都能摄取疫苗，但巨噬细胞中mRNA的稳定性更高，且再腺苷化更显著；而在树突状细胞中，去腺苷化仍占主导，导致mRNA稳定性迅速下降。巨噬细胞成为疫苗局部代谢的主要细胞群体。
第四阶段：体外巨噬细胞模型验证并解析再腺苷化的执行者TENT5A 为了深入研究，团队转向了体外培养的小鼠骨髓来源巨噬细胞和小人单核细胞来源巨噬细胞模型。在这些巨噬细胞中，他们成功复现了再腺苷化现象。在小鼠巨噬细胞中，mRNA-1273的poly(A)尾在转染24小时后中位延长了约24个腺苷酸，随后在72小时恢复原长。在人巨噬细胞中也观察到了类似的但程度较轻的再腺苷化。值得注意的是，BNT162b2在巨噬细胞中仅表现出轻微的poly(A)尾延伸，其抗原产生效率也低于mRNA-1273。
全转录组分析发现，巨噬细胞在摄取mRNA-1273后，不仅疫苗本身的poly(A)尾延长，还有124个内源性转录本（主要编码MHC成分、补体、溶酶体蛋白等免疫相关基因）的poly(A)尾也发生了显著延伸。这表明一个共同的、可能由疫苗诱导的因子介导了此过程。基因表达分析揭示，在mRNA-1273处理的巨噬细胞中，一种非经典的胞质聚腺苷酸聚合酶TENT5A 的表达被特异性显著诱导。TENT5A是唯一在疫苗注射部位被诱导表达的胞质聚腺苷酸聚合酶。
第五阶段：基因操作证实TENT5A的关键作用及机制 为了验证TENT5A的功能，研究团队使用了多种遗传学手段。在TENT5A和TENT5C双敲除的小鼠巨噬细胞中，mRNA-1273的再腺苷化能力完全丧失，取而代之的是快速的去腺苷化和降解，mRNA稳定性显著下降。通过可诱导降解的FKBP12F36V-HA-TENT5A小鼠模型，他们实现了TENT5A蛋白的快速敲低，并观察到同样的结果：mRNA-1273的poly(A)尾缩短。在人巨噬细胞中，用小干扰RNA敲低TENT5A也导致了mRNA-1273的poly(A)尾缩短和抗原产量减少。相反，敲低其他非经典poly(A)聚合酶如TENT2、TENT4等，并不影响再腺苷化。这些确凿的证据表明，TENT5A是介导mRNA-1273再腺苷化和稳定的关键因子。
第六阶段：探究TENT5A的底物特异性与机制——与内质网靶向相关 那么，TENT5A如何选择其底物？先前的研究表明，TENT5A和TENT5C的底物特异性并非由序列基序决定，而与蛋白质的内质网靶向信号相关。本研究也证实了这一点。在巨噬细胞中，发生再腺苷化的内源性mRNA大多编码内质网翻译的蛋白质，而mRNA-1273编码的刺突蛋白同样是在内质网上进行共翻译转运的。进一步实验发现，敲低介导TENT5C定位于内质网的跨膜蛋白FNDC3A和FNDC3B，同样会废除mRNA-1273的再腺苷化，表明TENT5A也需要与内质网微环境协作。 为了解释mRNA-1273和BNT162b2再腺苷化效率的差异，团队进行了细胞分馏实验。他们发现，当两种疫苗被共转染到巨噬细胞后，再腺苷化均特异性地发生在膜结合（内质网相关）的mRNA部分。BNT162b2在内质网上的负载量低于mRNA-1273，这解释了其总体再腺苷化程度较低的现象。此外，加帽策略也影响再腺苷化：使用酶法加帽（帽1）的报告mRNA能有效发生再腺苷化，而使用共转录CleanCap加帽的则不能。这种加帽方式的差异影响了翻译起始效率，从而可能影响了mRNA与内质网及TENT5A微环境的接触机会。UTR序列和poly(A)尾的具体组成对再腺苷化效率也有一定影响，但非决定性因素。
第七阶段：体内验证TENT5A对疫苗效力的影响 研究的最后，团队通过动物实验评估了TENT5A介导的再腺苷化是否真正影响疫苗的免疫原性。他们用mRNA-1273、BNT162b2或蛋白质疫苗（Nuvaxovid）免疫野生型小鼠和TENT5A敲除小鼠。结果显示，在接种mRNA-1273后第14天，TENT5A敲除小鼠血清中的抗刺突蛋白IgG抗体水平显著低于野生型小鼠。BNT162b2免疫后也观察到类似的但略弱的趋势。重要的是，在使用蛋白质疫苗时，TENT5A的缺失并不影响抗体水平，表明TENT5A的作用特异于mRNA疫苗本身。为进一步精确定位，他们使用了在CD11c+细胞（包括巨噬细胞和树突状细胞）中条件性敲除TENT5A的小鼠模型。在这些小鼠中，免疫后血清中的刺突蛋白抗原水平和后续的抗刺突蛋白IgG抗体水平均显著降低。这直接证明了表达TENT5A的CD11c+细胞（主要是巨噬细胞）通过再腺苷化促进抗原生产，从而对mRNA疫苗的效力至关重要。
结论与意义
本研究得出了以下核心结论：1. 治疗性mRNA的代谢远比之前认为的复杂，其poly(A)尾动态并非简单的单向缩短。2. 在巨噬细胞等靶细胞中，由疫苗诱导表达的胞质聚腺苷酸聚合酶TENT5A能够对编码分泌/膜蛋白的mRNA进行“再腺苷化”，从而显著延长其半衰期，增加抗原产量。3. 这一过程的效率受到mRNA的亚细胞定位（内质网关联性）、加帽策略、UTR和编码序列等多重因素影响。4. TENT5A介导的再腺苷化是mRNA-1273和BNT162b2等疫苗产生有效免疫应答的关键机制之一，特别是在巨噬细胞介导的抗原生产环节。
本研究的亮点与价值
科学价值： 1. 开创性发现： 首次在体内揭示了治疗性mRNA能被宿主细胞的poly(A)聚合酶“再加工”而稳定化，挑战了“治疗性mRNA稳定性仅由去腺苷化决定”的传统范式。 2. 机制深度： 不仅发现了现象，还通过严谨的遗传学、细胞生物学和测序技术，精确定位了关键执行者TENT5A，并初步阐明了其依赖于内质网微环境和FNDC3蛋白的作用机制。 3. 技术革新： 成功开发并应用了基于纳米孔直接RNA测序的增强分析流程，克服了化学修饰mRNA测序的难题，为研究治疗性RNA的代谢提供了强大的新工具。 4. 生理相关性： 将研究重点从传统的树突状细胞和细胞系模型，转向了在体内实际摄取疫苗的主要细胞——巨噬细胞，并揭示了其在抗原生产中的核心作用，更新了人们对mRNA疫苗作用机制的理解。
应用价值： 1. 指导下一代mRNA疗法设计： 研究明确指出了优化mRNA疗法的潜在路径。例如，通过调整mRNA的序列元件（如UTR）、加帽方法或编码序列，可以增强其与TENT5A系统的兼容性，从而提高在靶细胞内的稳定性和蛋白产量。 2. 个性化与精准靶向： 研究提示，不同细胞类型（如肝细胞 vs. 免疫细胞）表达不同的TENT5家族成员，未来可根据治疗目标组织和蛋白特性，定制设计更适合特定细胞mRNA稳定机制的药物。 3. 解释现有疫苗差异： 为理解不同mRNA疫苗（如mRNA-1273与BNT162b2）在免疫原性、效力持久性方面可能存在的细微差异提供了分子层面的潜在解释。 4. 拓宽mRNA技术边界： 这一原理不仅适用于传染病疫苗，也为基于mRNA的蛋白质替代疗法、癌症疫苗等其他治疗领域提供了提升疗效的新思路。
这项发表于《Nature》的研究，通过精妙的实验设计和前沿的技术手段，揭开了治疗性mRNA体内代谢的神秘面纱，发现了TENT5A介导的再腺苷化这一全新的增效机制。它不仅深化了我们对基础RNA生物学的认识，更为未来设计和优化更高效、更稳定的mRNA药物奠定了坚实的理论基础，具有里程碑式的意义。