本研究由 Nan Su、Ren Jie Phang、Anne M. Kong、Richard J. Macisaac、Shiang Y. Lim 及 Jarmon G. Lees 等人完成，主要作者来自澳大利亚墨尔本圣文森特医学研究所 O’Brien 研究所部门、墨尔本大学医学系以及莫纳什大学药物科学研究所等机构。该研究发表于 *Journal of Cardiovascular Development and Disease*，文章于2026年6月1日投稿，2026年7月21日接受并在线发表。
一、研究背景与目的
糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy）是2型糖尿病（type 2 diabetes, T2D）的严重并发症之一，在排除高血压、冠心病等基础心脏疾病后发生，影响超过30%的T2D患者，其五年内死亡率可达12.5%，预后甚至超过转移性乳腺癌。钠-葡萄糖协同转运蛋白2（sodium–glucose co-transporter 2, SGLT2）抑制剂如恩格列净（empagliflozin）在临床上不仅可控制血糖，还能降低糖尿病及非糖尿病患者的心血管住院率和死亡率。然而，SGLT2是否在心脏组织中表达，以及SGLT2抑制剂如何在心脏局部发挥作用，目前仍缺乏共识。传统观点认为SGLT2主要表达于肾近端小管，但近年研究发现其在晚期心肌病个体心脏组织中亦有表达，且高糖可诱导原代人源心肌细胞上调SGLT2表达。这些发现促使研究者重新审视SGLT2抑制剂的直接心脏保护作用。因此，本研究旨在利用人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, iPSCs）来源的心肌细胞、内皮细胞和心脏成纤维细胞，探讨SGLT2在心脏细胞中的表达定位以及恩格列净在糖尿病样应激条件下对不同心脏细胞类型的作用，并构建三维多细胞心脏微组织模型以模拟早期糖尿病心肌病表型。
二、研究流程与实验设计
研究从人iPSC细胞系CL2出发，分别定向分化为心肌细胞、内皮细胞和心脏成纤维细胞。心肌细胞分化采用Wnt信号通路时序激活与抑制的策略，并在第14天至第19天通过无糖乳酸培养基进行代谢纯化，仅使用心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T, cTnT）阳性率超过90%的批次。内皮细胞通过CD31阳性分选获得，在EGM-2MV培养基中扩增并使用第一代细胞。心脏成纤维细胞按照已有方案分化并在第29天使用。每种细胞类型均设置对照组（5.55 mM葡萄糖加甘露醇渗透压对照）、急性糖尿病样条件组（20 mM葡萄糖、0.25 mM棕榈酸、0.1 mM亚油酸、0.1 mM油酸、10 nM内皮素-1及1 µM皮质醇）以及糖尿病样条件加恩格列净处理组。心肌细胞和内皮细胞的恩格列净剂量为0.1、1和10 µM，心脏成纤维细胞使用10 µM，处理时间均为48小时。三维心脏微组织由140,000个纯化心肌细胞、55,000个内皮细胞和5,000个心脏成纤维细胞构成，在超低吸附板中形成细胞片层后嵌入基质胶，在轨道摇床上培养。微组织在构建四天后暴露于对照或糖尿病样条件48小时，随后在糖尿病样组中加入10 µM恩格列净继续处理48小时作为挽救模型，总处理时长96小时。
SGLT2蛋白表达通过蛋白质印迹（western blotting）检测，以人胚胎肾细胞（HEK）作为阳性对照，内参为钙联蛋白（calnexin）。SGLT2亚细胞定位通过免疫细胞化学染色检测，以cTnT、CD31和波形蛋白（vimentin）分别标记心肌细胞、内皮细胞和心脏成纤维细胞。细胞死亡通过碘化丙啶（propidium iodide, PI）和Hoechst 33258共染色进行量化。代谢活性使用CellTiter-Blue和CellTiter-Glo发光法分别测定二维细胞和三维微组织。心脏成纤维细胞活化以α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, αSMA）阳性细胞比例评估。微组织收缩功能通过明场显微镜以每秒60帧记录15秒视频，使用ImageJ软件中的MuscleMotion插件分析收缩持续时间、达峰时间、舒张时间和心率变异性（以连续R-R间期差值的均方根RMSSD表示）。统计采用Student t检验或单因素方差分析加事后检验，p<0.05为差异显著。
三、主要结果
蛋白质印迹结果显示，SGLT2蛋白在心肌细胞和内皮细胞中均有表达，但仅在内皮细胞中糖尿病样条件可使SGLT2表达上调3.1倍，心肌细胞中无显著变化。免疫荧光染色表明，三种细胞中SGLT2均呈点状核周和细胞核内分布，胞浆内亦有弥散信号，但未检测到膜定位。这一分布模式与原代人源心肌细胞中的报道一致，提示iPSC来源心肌细胞中的SGLT2表达并非未成熟细胞导致的假象。
糖尿病样条件使心肌细胞和内皮细胞死亡分别增加约4.7%和5.2%，并使两者的代谢活性均下降约0.6倍。在心肌细胞中，0.1、1和10 µM恩格列净均未改善代谢活性，说明心肌细胞在此条件下不是恩格列净的直接细胞靶点。相反，在内皮细胞中，各剂量恩格列净均显著部分恢复代谢活性，提升幅度为10.5%至11.2%，其中10 µM效果最佳，因此被用于后续心脏成纤维细胞和微组织实验。糖尿病样条件使心脏成纤维细胞活化比例较对照增加33.7%，与糖尿病心肌病的促纤维化表型一致；10 µM恩格列净显著降低αSMA阳性细胞比例，使其恢复至对照水平。
三维心脏微组织中，免疫荧光显示cTnT阳性心肌细胞分布于微组织外周，CD31阳性内皮细胞散布于内部，波形蛋白阳性的心脏成纤维细胞主要分布于心肌细胞间质。48小时基线时，对照组和糖尿病样组的收缩持续时间、舒张时间、达峰时间和心率变异性均无显著差异。96小时时，糖尿病样条件显著降低微组织代谢活性，而恩格列净处理使其代谢活性维持在对照水平。收缩轨迹显示糖尿病样微组织的舒张期明显延长，定量分析证实舒张时间显著延长，但总收缩持续时间和达峰时间不受影响。心率变异性（RMSSD/RRint）在糖尿病样条件下显著降低，与临床糖尿病心肌病中观察到的自主神经功能异常一致。然而，10 µM恩格列净未能改善舒张时间、心率变异性或任何其他收缩参数。
四、结论与意义
本研究首次在iPSC来源的人源心肌细胞、内皮细胞和心脏成纤维细胞中系统描述了SGLT2的核周和核内定位特征，且未见膜定位。研究发现糖尿病样应激条件下，SGLT2仅在内皮细胞中上调，心肌细胞无变化。功能上，恩格列净在内皮细胞和心脏成纤维细胞中表现出显著的保护作用，而对心肌细胞无效。三维微组织模型成功再现了早期糖尿病心肌病的舒张功能障碍和心率变异性降低，恩格列净虽可维持代谢活性但未能逆转收缩功能障碍。综合结果表明，SGLT2抑制剂的临床心脏保护作用可能至少部分通过非心肌细胞（内皮细胞和心脏成纤维细胞）介导，而非直接作用于心肌细胞。由于SGLT2未定位于细胞膜，其作用可能涉及SGLT2非依赖的替代分子靶点，如钠氢交换体1抑制、SGLT1抑制、自噬调节或炎症和神经体液调节等。该研究为理解SGLT2抑制剂在心脏中的作用机制提供了新的细胞类型特异性证据，并建立了可模拟早期糖尿病心肌病表型的人源iPSC多细胞平台。
五、研究亮点
本研究的亮点在于同时使用三种人源心脏细胞类型和三维多细胞微组织模型，在统一糖尿病样应激条件下进行细胞类型特异性功能比较；首次通过免疫荧光在iPSC来源内皮细胞和心脏成纤维细胞中描述SGLT2的核周和核内定位；并采用挽救式给药设计模拟临床治疗场景。研究还比较了二维与三维模型中恩格列净疗效的差异，提示细胞间相互作用和组织空间结构可能影响药物应答，为后续机制研究提供了重要方向。此外，研究指出iPSC来源心肌细胞的相对不成熟性可能影响功能性恢复的检测，但SGLT2蛋白表达模式与原代细胞一致，支持该模型在心脏SGLT2研究中的相关性。作者亦提出SGLT2敲低实验和更大剂量范围的心脏成纤维细胞功能分析可作为未来研究重点。