本研究由Anagha Priya Suresh、Sreeram Peringattu Kalarikkal、Bhoomireddy Pullareddy和Gopinath M. Sundaram等人完成，通讯作者Gopinath M. Sundaram来自印度CSIR-中央食品技术研究所（CSIR-Central Food Technological Research Institute）分子营养系。该论文于2021年7月1日发表于ACS Omega期刊，题为“Low pH-Based Method to Increase the Yield of Plant-Derived Nanoparticles from Fresh Ginger Rhizomes”。
一、研究背景与目的
植物来源纳米颗粒（plant-derived nanoparticles, PDNPs）是从膳食植物中分离得到的类外泌体纳米囊泡，直径通常在100至500纳米之间，其脂质双层膜内包裹有蛋白质、小RNA及其他植物活性成分。生姜来源的PDNPs已被证明对酒精性肝损伤、炎症性肠病和结肠癌具有治疗潜力，同时也可作为纳米载体用于递送siRNA和化疗药物。然而，PDNPs的传统纯化方法为差速超速离心（differential ultracentrifugation），该方法成本高且难以规模化放大。研究团队此前已开发了基于聚乙二醇6000（PEG6000）沉淀的低成本纯化方法，其效率与超速离心相当。在此基础上，本研究旨在进一步优化该方法，通过调节PEG沉淀过程中的pH条件来提高生姜PDNPs的产量，同时保持其关键的生物物理和生化特性。
二、研究流程与实验方法
本研究首先将生姜根茎洗净匀浆，经尼龙网过滤后依次进行低速（2000×g、6000×g）和中速（10,000×g）离心，获得S10上清液。将S10上清液等分为六份，分别用11 N盐酸或1 N氢氧化钠将pH调节至4、5、6、7、8和9，然后加入PEG6000至终浓度10%（质量体积比），在4°C下孵育过夜。次日以8000×g离心30分钟收集沉淀，将沉淀重悬于无菌水中至终浓度0.5 mg/μL，并用截留分子量为10 kDa的透析膜对Milli-Q水透析过夜以去除残留PEG。
在生物物理特性表征方面，研究使用Malvern Zeta Sizer Nano ZS在室温下对稀释后的PDNPs样品进行粒径和zeta电位测量，每个样品至少重复测量三次，并统计至少三个独立批次的数据。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析采用衰减全反射模式，光谱采集范围为4000至400 cm⁻¹，并进行背景扣除、基线校正和光谱平滑处理。总脂质采用氯仿-甲醇等体积混合提取，通过硅胶60 F254薄层色谱板以氯仿/甲醇/乙酸（95:4.5:0.5体积比）为流动相进行分离，用10%硫酸铜和8%磷酸染色后炭化显影。
总多酚含量（total polyphenolic content, TPC）的测定采用Folin-Ciocalteu法：PDNPs经甲醇提取后，与Folin-Ciocalteu试剂和7.5%碳酸钠反应，室温孵育30分钟后在765 nm处比色测定，以没食子酸为标准品绘制标准曲线。抗氧化活性通过DPPH自由基清除实验评估：将PDNPs甲醇提取物与0.2 mM DPPH溶液混合，室温孵育30分钟后在517 nm处测定吸光度。此外，还通过过氧化氢（H₂O₂）诱导的氧化应激模型在A431表皮样癌细胞上评价了PDNPs的体外抗氧化保护能力：细胞以每孔15000个的密度接种于96孔板，24小时后单独用500 μM H₂O₂处理或同时加入150 μg PDNPs共处理，孵育6小时后通过MTT法测定细胞活力。
细胞内摄取实验采用亲脂性荧光染料Nile Red标记PDNPs：在pH调节前将Nile Red加入S10提取液至终浓度1 μM，使未结合的染料在后续离心步骤中被去除。A431细胞以每孔50000个的密度接种于含玻璃盖玻片的24孔板中，24小时后用500 μg Nile Red标记的PDNPs处理5小时，经PBS洗涤和4%多聚甲醛固定后，用DAPI复染细胞核，在Olympus IX73倒置荧光显微镜20倍物镜下观察。
小RNA分析方面，从PDNPs中提取总RNA后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，并用RNase A处理验证小RNA群体的RNA属性。随后使用poly A聚合酶对成熟miRNA进行多聚腺苷酸化，用含接头序列的oligo(dT)引物反转录合成cDNA，稀释10倍后利用miRNA特异性正向引物和含接头序列的反向引物进行定量PCR，检测六种miRNA（miR-156a、miR-159、miR-5077、miR-6300、miR-166和miR-5059）的相对丰度。
三、主要实验结果
在pH对PDNP产量的影响方面，研究发现当S10上清液的pH调节至4和5时，PEG沉淀获得的生姜PDNP产量显著增加。多个独立批次的统计结果显示，pH 4和pH 5条件下的PDNP回收率比pH 6至9条件下高出4至5倍。碱性条件下虽有轻微产量增加，但未达到统计学显著水平。粒径测量表明，pH 4和pH 5条件下分离的PDNP粒径显著小于碱性条件下分离的PDNP，而zeta电位在pH 4至9的范围内无显著变化。FTIR分析显示，不同pH条件下分离的PDNP整体吸收光谱相似，但pH 4和pH 5样品在3300、1531和1638 cm⁻¹处呈现增强的吸收峰，其中1638 cm⁻¹和1531 cm⁻¹分别对应酰胺I带和酰胺II带，提示低pH条件下分离的PDNP可能含有更高比例的蛋白质。薄层色谱分析表明，不同pH条件下的PDNP总体脂质谱相似，但pH 4条件下的脂质条带更为浓密，与其较高的PDNP产量一致。
在生物利用度方面，A431细胞与等浓度Nile Red标记的PDNP孵育5小时后，所有pH条件下分离的PDNP均能被细胞内化。与模拟处理细胞相比，PDNP处理细胞呈现明显的细胞质荧光，但不同pH条件之间的荧光强度或荧光细胞数量无显著差异，表明低pH条件下分离的PDNP具有同等的生物利用度。
在生物活性成分方面，pH 4和pH 5条件下纯化的PDNP总多酚含量显著高于中和碱性条件下纯化的PDNP，增幅为3至4倍。DPPH自由基清除实验也显示低pH来源的PDNP具有更高的抗氧化活性。然而，在H₂O₂诱导的细胞氧化应激模型中，pH 4至8条件下分离的PDNP均能挽救H₂O₂引起的细胞死亡，但不同pH条件之间的保护效果无显著差异。
在小RNA含量方面，琼脂糖凝胶电泳证实所有pH条件下分离的PDNP均含有大小一致的小RNA群体，且这些小RNA对RNase A敏感。六种miRNA在所有PDNP样品中均可检测到扩增，无模板cDNA的对照反应则无扩增产物。定量结果显示，pH低于6的酸性条件下分离的PDNP中六种miRNA的水平均有所降低，其中pH 4条件下miRNA水平最低，miR-166因其本身在PDNP中表达水平较低而降低最为明显。pH 5条件下的miRNA表达水平高于pH 4，其中三种miRNA（miR-5077、miR-6300和miR-5059）的ct值仍保持在15至25之间。
四、结论与意义
本研究成功开发了一种通过降低PEG沉淀过程中的pH来提高生姜PDNP产量的方法。在pH 4和pH 5条件下，PDNP回收率较中和碱性条件提高4至5倍，且低pH来源的PDNP粒径更小、总多酚含量更高、脂质含量更丰富，并保持了相当的zeta电位、细胞内摄取能力和体外抗氧化活性。更重要的是，低pH条件下纯化的PDNP仍保留了关键的生物活性miRNA，包括此前被预测可靶向SARS-CoV-2的miRNA种类。考虑到pH 5条件下5倍于常规产量的优势，该条件下miRNA相对含量的降低可以通过增加给药剂量来弥补。这一改良方法在保持PDNP主要生物活性成分不受影响的前提下实现了高产率纯化，为PDNP在治疗和纳米载体应用中的规模化生产提供了可行的技术方案。
五、研究亮点
本研究的核心创新在于将pH调节策略整合到已建立的PEG6000沉淀方法中，在不增加复杂设备或步骤的情况下实现了5倍的产量提升。研究发现酸性环境不仅增加了PDNP的回收率，还提高了多酚和蛋白质等生物活性成分的相对含量，同时保持了纳米囊泡的细胞摄取能力和抗氧化功能。这一发现与哺乳动物外泌体在酸性条件下稳定性增强的已有报道相呼应，为植物来源纳米颗粒的规模化制备提供了理论依据和实践指导。