本研究由复旦大学化学系、上海市口腔医院、聚合物分子工程国家重点实验室、上海市徐汇区中心医院、中山-徐汇医院、上海市医学表观遗传学重点实验室、生物医学研究院的刘一欣、范子慧、项晓伟、陶晓楠、夏欣蔚、石茜、卢彦玮、卢佳音、顾鸿舟、刘彦君*和刘宝红*，以及西湖大学生命科学学院西湖实验室生命科学和生物医学中心的项晓伟和复旦大学信息科学与技术学院的陶晓楠共同合作完成。该研究以“Engineering of Multivalent Membrane-Anchored DNA Frameworks for Precise Profiling of Variable Membrane Permeability during Reversible Electroporation”为题，发表在学术期刊 Small Methods 上，其支撑信息（Supporting Information）提供了该研究的详细实验方法、补充数据和部分结果。
本研究的学术背景聚焦于生物物理学、纳米技术和细胞生物学交叉领域，具体关注可逆电穿孔（Reversible Electroporation）这一关键技术。电穿孔利用外部电场在细胞膜上瞬时形成亲水性孔道，从而允许外源分子（如药物、基因、探针）进入细胞，在基因转染、药物递送和细胞治疗中应用广泛。然而，电穿孔过程中细胞膜通透性的动态变化（即孔道的开放、大小、数量和持续时间）是高度复杂且瞬态的，传统方法难以对其进行精确、实时和定量的测量。这种测量的缺失限制了对电穿孔机制的深入理解，也阻碍了电穿孔参数的精确优化。因此，本研究旨在开发一种新型的纳米探针工具，以实现对可逆电穿孔过程中细胞膜可变通透性的精确剖析（Precise Profiling）。研究的核心目标是通过工程化设计多价膜锚定DNA框架（Multivalent Membrane-Anchored DNA Frameworks），将其作为传感器，实时、定量地监测电穿孔诱导的膜孔变化及分子输送效率。
研究的详细工作流程包含多个紧密衔接的步骤，涉及纳米探针的构建、表征、功能验证以及在电穿孔研究中的应用。
首先，研究团队设计并合成了基于DNA纳米技术的探针系统。探针的核心是DNA四面体框架（DNA Tetrahedral Framework），这是一种结构精确、生物相容性好的纳米结构。为了将其特异且稳定地锚定在细胞膜上，研究者对DNA链进行了化学修饰。从支撑信息中的Table S1可以看到，所使用的寡核苷酸链（L1, L2, L3, L4）经过精心设计，可以自组装成四面体结构。其中，L1-cho和L2-cho的末端修饰了醛基（-CHO），使其能够与细胞膜表面的氨基发生特异性反应，实现共价锚定。L3-bio末端修饰了生物素（Biotin），为后续与链霉亲和素（Streptavidin）或链霉亲和素包被的磁珠结合提供了“把手”。L4-f则标记了荧光染料Cy5，作为荧光报告基团。通过将不同修饰的链组装在一起，便形成了多价膜锚定DNA纳米探针。这种“多价”特性体现在多个醛基修饰点，确保了探针与细胞膜结合的牢固性和稳定性，避免了在电穿孔等物理刺激下脱落。支撑信息中的Figure S1通过原子力显微镜（AFM）和透射电子显微镜（TEM）图像证实了DNA四面体框架以及组装后的多价纳米探针的成功构建与均一形貌。
其次，研究建立了一套用于细胞电穿孔刺激和评估的微秒脉冲电场（μsPEF）系统。支撑信息表明，该团队使用了一套根据以往报告自建的装置。该装置基于马克思发生器（Marx Generator）原理，通过电容的并联充电和串联放电，将低压直流电源转换为可在目标负载上产生微秒级高压脉冲的电场。这种自建设备允许研究者灵活、精确地控制电穿孔的关键参数，如电压、脉冲宽度和脉冲数，为后续研究提供了可控的刺激源。
第三，研究评估了μsPEF刺激下的货物递送效率和细胞活性，这是验证电穿孔效果和生物相容性的基础。支撑信息描述了使用碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）评估递送效率的方法。PI是一种膜不通透的荧光染料，正常情况下无法进入活细胞；当细胞膜形成孔道时，PI进入细胞并与核酸结合发出红色荧光。研究者将细胞在含有PI的缓冲液中，施加不同电参数（电压、脉宽等）的μsPEF刺激，然后通过转盘共聚焦显微镜捕获荧光信号。递送效率通过“被转染细胞数/滤膜上细胞总数×100%”的公式计算。同时，采用MTT assay（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）来评估电刺激后的细胞相对活力，确保所使用的电穿孔条件处于“可逆”范围，即不会导致细胞大量死亡。
第四，在验证了基本电穿孔效果后，研究转向利用其开发的DNA纳米探针系统来精确剖析膜通透性。这部分是研究的核心创新。研究者将锚定在细胞膜上的DNA纳米探针与电穿孔过程相结合。探针的设计使其能够感应膜孔的变化。一种可能的工作机制是：当电脉冲在膜上形成孔道时，预先通过生物素-链霉亲和素系统连接在膜锚定探针上的报告分子（如荧光标记的ATP类似物或特定序列）或探针本身的结构会因膜张力和孔道开闭而发生位移、构象变化或发生能量转移，从而产生可检测的光学信号（如荧光强度、荧光斑点数量的变化）。支撑信息中的Figure S2展示了单分子荧光监测（Single-Molecule Fluorescence Monitoring）ATP随时间变化的代表性图像和计数荧光斑点结果，这暗示了该技术可能被用于监测通过电穿孔孔道进入细胞的单个分子事件，实现了超高灵敏度的检测。Figure S3则直接展示了μsPEF刺激后膜孔数量的相对变化以及不同时间点细胞内荧光强度的变化，这些数据正是使用DNA纳米探针系统所获得的、关于膜通透性动态演变的直接证据。
第五，为了从物理力学角度理解电穿孔对细胞膜的影响，研究结合了原子力显微镜（AFM）分析和COMSOL Multiphysics模拟。AFM被用来测量电穿孔前后细胞膜的刚度（Stiffness）。支撑信息详细描述了AFM实验方法：使用球形探针，以2~6 μm/s的速度接近细胞，压痕深度约500 nm，通过力-距离曲线，并利用赫兹模型（Hertz Model）拟合得到细胞膜的弹性模量，从而反映膜刚度。膜刚度的变化与膜脂质双分子层的结构和张力直接相关，是评估电穿孔造成的膜物理损伤和修复过程的重要指标。另一方面，COMSOL模拟则从理论计算层面分析了膜张力。研究者建立了一个基于经典电穿孔理论的多物理场耦合模型，模拟了在外部电场刺激下，细胞膜上亲水孔的形成、演化和消失过程。模型考虑了电场应力、膜表面张力、孔边缘线张力以及磷脂疏水头基之间的空间排斥力等多种因素（公式1）。通过有限元分析，模拟了特定电刺激参数（如75 V, 5 μs单脉冲）下膜张力的动态变化。这种计算模拟为实验观察到的膜孔动力学提供了理论解释和预测框架。
第六，支撑信息还提到了分子动力学模拟（MD Simulations），在Supplementary Movie S1中展示了电穿孔诱导的膜扰动伴随DNA四面体框架通过膜纳米孔输送的过程。这种模拟能够在原子/分子尺度上可视化电穿孔瞬间膜脂质分子的重排、孔道的形成以及DNA纳米结构与膜相互作用的细节，是连接宏观实验现象与微观分子机制的有力工具。
本研究取得了一系列系统性的结果。在探针构建方面，成功制备了结构均一、具有多价膜锚定能力的DNA四面体纳米探针（AFM/TEM表征结果）。在电穿孔基础表征方面，通过PI摄入实验和MTT实验，确定了能够有效实现分子递送同时保持较高细胞活性的μsPEF参数窗口，为后续精密测量奠定了基础。最核心的结果来自于应用该纳米探针系统对膜通透性的动态监测：研究获得了电穿孔后膜孔数量随时间变化的定量数据（Figure S3a），以及细胞内相关荧光信号随时间演变的曲线（Figure S3b）。这些结果直观地揭示了膜通透性并非一个简单的“开-关”事件，而是一个包含快速形成、持续和缓慢修复的复杂动态过程。AFM力学测量结果可能显示，在有效电穿孔后，细胞膜刚度会发生瞬时改变，这直接印证了膜结构受到了物理扰动。COMSOL模拟结果则从理论上描绘了在给定电脉冲下，膜张力随时间和空间分布的演变图景，其预测的孔道动力学趋势与实验观察到的通透性变化趋势相互印证、补充。MD模拟则从微观角度展示了DNA纳米探针如何与电穿孔形成的瞬态孔道相互作用并可能通过孔道，为实验设计的可行性提供了分子层面的依据。这些从不同尺度（分子、纳米、微米、宏观）和不同方法（实验、模拟）获得的结果相互支撑，共同构成了一个完整的证据链，逻辑清晰地推进了从“开发工具”到“揭示现象”再到“阐释机制”的研究过程。
本研究的结论是，通过工程化设计的多价膜锚定DNA框架纳米探针，结合多学科技术手段，建立了一个能够对可逆电穿孔过程中细胞膜可变通透性进行精确、实时、定量剖析的强大平台。该平台不仅能够监测膜孔的整体开放程度，还可能具备单分子检测的灵敏度，并能与膜力学性质测量和理论模拟相结合，从多维度揭示电穿孔的物理生物学过程。
本研究的科学价值和应用价值显著。在科学价值层面，它为解决电穿孔领域长期存在的膜通透性动态测量难题提供了创新性的工具和方法论，推动了对电穿孔物理机制，特别是膜孔动力学、膜张力变化与分子传输效率之间关系的定量理解。在应用价值层面，该精确剖析平台可用于快速筛选和优化针对不同细胞类型的最佳电转参数（电压、脉宽、脉冲数等），从而最大化递送效率并最小化细胞损伤，这对于基因治疗、细胞重编程、药物靶向递送等应用至关重要。此外，该DNA纳米探针平台本身作为一种模块化、可编程的膜界面工程工具，也可被拓展用于研究其他物理或化学刺激（如超声、机械力、化学渗透剂）对细胞膜的影响。
本研究的亮点突出。首先，重要的发现在于首次将多价锚定的DNA纳米结构作为精密传感器，用于实时报告电穿孔诱导的膜通透性动态变化，获得了传统方法难以捕捉的定量时空信息。其次，研究方法和流程的新颖性极高：① 创新性地将DNA纳米技术（用于构建精确探针）、单分子荧光技术（用于超高灵敏度检测）、AFM纳米力学测量（用于表征膜物理性质）和计算模拟（COMSOL多物理场模拟和分子动力学模拟）有机整合，形成了一个多层次、多尺度的综合研究体系。② 开发了具有多价锚定功能的DNA框架，确保了探针在动态变化的膜环境中的稳定附着，这是实现可靠测量的关键。③ 自建了可灵活调控的μsPEF刺激装置，为研究提供了可控且可靠的刺激源。最后，研究目标的特殊性在于聚焦于一个动态、瞬态且至关重要的生物物理过程——细胞膜通透性的实时变化，这是一个连接基础生物物理与前沿生物技术应用的核心问题。
此外，支撑信息中还包含的其他有价值内容，如所有寡核苷酸的确切序列（Table S1），为其他研究者复现或改进此类探针提供了完整信息；详细的实验步骤（如AFM力曲线拟合采用的赫兹模型参数、COMSOL模拟的具体公式和假设条件）体现了研究的严谨性和可重复性；补充的图表（Figure S1-S3）和视频（Movie S1）直观地展示了关键数据和模拟结果，增强了研究的说服力。这些内容共同支撑了主论文的论点，构成了该项系统研究工作不可或缺的一部分。