本研究由南京林业大学园林学院的Jianpan Xin、Chu Zhao、Yan Li、Wenke Ji和Runan Tian（通讯作者）共同完成，并于2025年发表在学术期刊 Plant Physiology and Biochemistry 上（卷223，文章号109814）。

一、 研究的学术背景

本研究属于植物生理学、环境胁迫生物学以及入侵生态学的交叉领域。铜（Cu）是植物必需的微量元素，但人类活动导致水体中铜离子（Cu²⁺）浓度升高，对水生植物构成潜在毒害。过量的铜会引发活性氧爆发，破坏DNA、膜脂和蛋白质，干扰光合作用、呼吸作用等关键代谢过程，抑制植物生长。

与此同时，入侵植物通常对污染环境表现出强大的适应性和耐受性，是研究植物抗逆机制和用于植物修复（phytoremediation）的宝贵资源。天胡荽（*Hydrocotyle verticillata*）作为一种入侵植物，已被证明对多种潜在有毒元素（Potentially Toxic Elements, PTEs）具有耐受性，是修复PTEs污染水体的候选植物。然而，其耐受铜胁迫的内在分子机制尚不明确。

因此，本研究旨在通过整合转录组学（transcriptome）和代谢组学（metabolomics）分析，揭示天胡荽在应对不同浓度铜胁迫时，其叶片在基因表达和代谢物层面的动态变化，从而阐明其关键的防御代谢通路和耐受策略。

二、 详细研究流程

本研究设计严谨，流程清晰，主要包含以下几个核心步骤：

1. 植物材料处理与实验设计： * 研究对象： 入侵植物天胡荽（*Hydrocotyle verticillata*）。 * 处理设置： 水培实验设置了三个处理组：0 μM Cu²⁺（对照组，CK）、45.0 μM Cu²⁺（低浓度处理组，T1）和90.0 μM Cu²⁺（高浓度处理组，T2）。每组设置三个生物学重复。 * 处理过程： 植株在适应培养后，分别在不同浓度的Cu²⁺溶液中处理7天，直至观察到叶片出现失绿症状（附录图S1），然后采集植株顶部的鲜嫩叶片用于后续分析。

2. 转录组学分析： * RNA提取与测序： 使用TRIzol试剂盒提取叶片总RNA。使用Agilent 2100 Bioanalyzer和琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。合格的总RNA经Oligo(dT)磁珠富集mRNA，片段化后反转录成cDNA，构建文库，最后在Illumina HiSeq2500平台上进行高通量测序。 * 数据处理与组装： 使用fastp (v0.18.0) 软件对原始测序数据进行质量控制，过滤掉含接头、未知碱基（N）比例过高或低质量碱基比例过高的reads。使用Trinity软件对高质量reads进行从头（de novo）组装，获得转录本（unigenes）。通过N50值、序列长度和BUSCO（Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs）评估组装质量。 * 差异表达基因（DEGs）鉴定与富集分析： 使用DESeq2软件进行差异表达分析，筛选条件为错误发现率（FDR）< 0.05且表达倍数变化（fold change）绝对值 ≥ 2。对鉴定出的DEGs进行功能注释，使用的数据库包括非冗余蛋白序列（NR）、SwissProt、京都基因与基因组百科全书（KEGG）、直系同源蛋白簇（KOG）和基因本体（GO）。随后进行GO功能富集和KEGG通路富集分析，以确定DEGs主要参与的生物学过程和代谢通路。

3. 代谢组学分析： * 样本制备与检测： 将叶片样本液氮速冻后于-80°C保存。样本提取和色谱-质谱分析由广州基因德诺生物科技有限公司完成。基于该公司标准，对铜处理植物叶片中的代谢物进行非靶向检测和鉴定。 * 差异表达代谢物（DEMs）鉴定与富集分析： 利用正交偏最小二乘判别分析（(O)PLS-DA）模型的变量重要性投影（VIP）值（阈值≥1）结合t检验（p < 0.05）来筛选差异代谢物。将鉴定出的DEMs映射到KEGG数据库进行通路注释和富集分析。

4. 转录组与代谢组整合分析： * 将所有DEGs和DEMs映射到KEGG通路数据库，找出共同富集的通路。 * 使用R语言中的OmicsPLS包进行双向正交偏最小二乘（O2PLS）分析，以整合转录组和代谢组数据。 * 使用R图形软件包计算转录组和代谢组数据之间的皮尔逊相关系数，评估两组学数据的关联性。

5. RT-qPCR验证： * 为了验证转录组测序结果的可靠性，研究选择了6个基因（*WRKY7*、*WRKY33*、*WRKY40*、*bZIP29*、*bZIP53*、*bZIP60*）进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证。每个样本设置三个生物学重复和技术重复。结果表明，RT-qPCR测得的基因相对表达水平与RNA-seq结果一致，证实了测序数据的可靠性。

三、 主要研究结果

1. 转录组测序质量与差异基因表达概况： 测序数据质量高（Q20 ≥ 97.50%， Q30 ≥ 92.51%），组装质量良好（N50值为15,866 bp）。相关性分析显示生物学重复性好。共鉴定出1896个DEGs。具体而言，与CK相比，T1组（45.0 μM Cu²⁺）有903个DEGs（688个上调，215个下调），T2组（90.0 μM Cu²⁺）有1405个DEGs（1106个上调，299个下调）。T1与T2组之间有377个DEGs。三组共有58个DEGs。

2. 差异基因的功能富集： GO富集分析显示，DEGs主要涉及细胞过程、代谢过程、对刺激的反应、催化活性、结合、转运活性等。KEGG通路富集分析揭示了关键通路： * 在CK-vs-T1和CK-vs-T2组中，DEGs显著富集于核糖体、角质、木栓质和蜡质生物合成（cutin, suberin, and wax biosynthesis）、氧化磷酸化、类胡萝卜素生物合成（carotenoid biosynthesis）和甘油脂代谢等通路。 * 在T1-vs-T2组中，DEGs主要富集于萜类化合物生物合成（terpenoid biosynthesis），尤其是类胡萝卜素、单萜、卟啉代谢、萜类骨架、倍半萜和三萜生物合成通路。

3. 差异代谢物鉴定与通路富集： 共鉴定出241个DEMs。在CK-vs-T1组有143个DEMs（11上，132下），CK-vs-T2组有92个（25上，67下），T1-vs-T2组有89个（63上，26下）。KEGG富集分析显示，DEMs在α-亚麻酸代谢（α-linolenic acid metabolism）、β-丙氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、氮代谢、GABA能激动剂/拮抗剂、萜类骨架生物合成和类胡萝卜素生物合成等通路中显著富集。

4. 整合分析揭示的关键防御通路： 通过整合转录组和代谢组数据，研究确定了天胡荽响应铜胁迫的多个关键代谢通路，这些通路在两种浓度处理下均被共同调控，包括：类胡萝卜素代谢、角质/木栓质/蜡质生物合成、类黄酮生物合成、谷胱甘肽代谢、亚油酸代谢、苯丙烷类生物合成、植物激素信号转导、倍半萜和三萜生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢以及氨基酸生物合成。

5. 针对不同浓度铜胁迫的具体防御机制： * 应对45.0 μM Cu²⁺（T1）： * 类胡萝卜素代谢： 代谢物花药黄质（antheraxanthin） 含量上调，有助于淬灭活性氧。 * 氨基酸代谢： 代谢物γ-L-谷氨酰半胱氨酸（γ-l-glutamylcysteine）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）和肌肽（carnosine） 含量下调。研究推测这可能与氨基酸和自由基的过氧化有关，而肌肽可通过其咪唑环提供活性氢来清除自由基。 * 植物激素信号： 水杨酸（SA）信号通路被激活，但一个编码病程相关蛋白（PR1） 的基因下调，可能破坏了叶际微生物群落稳态，导致失绿，对耐受性产生负面影响。 * 共同响应： 与CK相比，两个铜处理均上调了编码脂肪酸ω-羟化酶的基因（参与角质/蜡质合成）和十六烷二酸（hexadecanedioic acid） 的含量，以及编码生长素响应蛋白（GH3） 的基因。十六烷二酸可螯合金属离子，GH3通过调节游离内源激素水平参与抗逆。

• 应对90.0 μM Cu²⁺（T2）：
  • 类胡萝卜素代谢： 叶黄素（lutein）和3,4-二氢螺菌黄质（3,4-dihydrospheroidene） 含量增加。编码β-胡萝卜素羟化酶（BCH） 和ABA 8‘-羟化酶（CYP707A） 的基因上调。BCH上调促进叶黄素合成以稳定膜系统。CYP707A上调促进了ABA的分解，导致脱落酸（ABA） 含量下降，这表明在高铜胁迫下，天胡荽可能通过负调控ABA来响应。
  • 氨基酸代谢： 亚油酸（linoleic acid）、L-谷氨酰胺（L-glutamine）和焦谷氨酸（pyroglutamic acid） 含量上调。亚油酸增强膜流动性；谷氨酰胺参与氮转运和抗氧化防御；焦谷氨酸是谷胱甘肽代谢中间产物，能增强光合和抗氧化酶活性。
  • 植物激素信号：
    • 油菜素内酯（BR）信号通路： 编码油菜素类固醇抗性1/2（BZR1/2） 转录因子和木葡聚糖：木葡糖基转移酶（TCH4） 的基因上调。BZR1/2能提高抗氧化酶活性，TCH4参与细胞壁修饰，可能增强细胞壁稳定性。然而，编码BAK1的基因下调，该基因负调控程序性细胞死亡（PCD）。研究者推测，BAK1的下调可能触发了程序性细胞死亡，且这一过程可能不依赖于BR信号通路。
    • 细胞分裂素（CTK）信号： 编码组氨酸磷酸转运蛋白（AHP）的基因上调，而细胞分裂素通常负调控植物抗逆性，因此AHP上调可能对耐受性产生不利影响。
    • MYC2转录因子： 在两个铜处理下均上调，它参与单萜和吲哚生物碱的生物合成，其具体作用有待进一步研究。

四、 研究结论与意义

本研究通过整合转录组和代谢组学分析，系统阐明了入侵植物天胡荽应对不同浓度铜胁迫的分子与代谢调控网络。主要结论如下： 1. 天胡荽通过调控多条代谢通路协同防御铜胁迫，包括类胡萝卜素代谢、角质/蜡质合成、氨基酸代谢、植物激素信号转导、苯丙烷类和萜类代谢等。 2. 防御策略具有浓度特异性：低浓度（45.0 μM）胁迫下，主要依赖花药黄质、特定氨基酸代谢物（如肌肽）和水杨酸信号通路进行防御。高浓度（90.0 μM）胁迫下，则激活了更广泛的通路，包括叶黄素合成、ABA分解代谢、谷氨酰胺和焦谷氨酸积累，以及油菜素内酯信号通路（BZR1/2, TCH4）和可能由BAK1下调触发的程序性细胞死亡机制。 3. 某些响应是普遍性的：无论铜浓度高低，植物都通过上调角质/蜡质生物合成相关基因（增加十六烷二酸）和GH3基因来增强耐受性。

科学价值： 本研究首次在转录组和代谢组水平上全面揭示了天胡荽耐受铜胁迫的复杂机制，为理解入侵植物在重金属污染环境中的生态适应策略提供了新的分子见解。特别是发现了浓度依赖性的防御路径切换，以及激素信号（如ABA、BR、SA）在调控耐受性中的精细且有时相悖的作用。 应用价值： 研究结果有助于筛选用于植物修复的关键基因和代谢物，为利用天胡荽或其他耐受植物进行铜污染水体的生物修复提供了理论基础和潜在的遗传改良靶点。

五、 研究亮点

1. 多组学整合分析： 采用转录组与代谢组联合分析，不仅发现了差异表达的基因和代谢物，更关键的是通过整合分析找到了连接基因变化与代谢表型变化的关键通路，构建了从基因到表型的调控网络，使机制阐释更加系统和深入。
2. 浓度梯度设计： 设置了0、45.0、90.0 μM三个铜浓度处理，能够区分植物对不同程度胁迫的响应差异，揭示了防御策略的动态性和层次性。
3. 机制阐释的深度： 研究不仅停留在通路富集层面，还深入分析了关键基因（如*CYP707A*、*BAK1*、*BZR1/2*、*GH3*）和代谢物（如花药黄质、十六烷二酸、谷氨酰胺）的具体功能，并提出了具有逻辑性的生物学解释和假设（如ABA的负调控、BAK1下调可能触发PCD）。
4. 聚焦入侵植物： 研究对象是具有强环境适应性的入侵植物，其耐受机制的研究对于理解生物入侵的生理生态基础以及开发其在环境修复中的应用潜力具有双重意义。
5. 数据验证充分： 通过RT-qPCR对关键转录因子基因进行了验证，确保了转录组数据的可靠性。

六、 其他有价值的内容

研究在讨论部分还引用了大量相关文献，将本研究发现与其他植物（如*Pistia stratiotes*、*Triticum aestivum*、*Arabidopsis thaliana*）在重金属胁迫下的响应机制进行了对比和关联，增强了研究结论的普适性和在更广泛植物抗逆生物学背景下的定位。例如，指出*CYP707A*在水稻响应干旱和砷胁迫中也有类似功能；*BZR*转录因子在拟南芥中已知能提高非生物胁迫耐受性等。这些横向比较提升了研究的深度和学术价值。