本研究由Yuyang Wang、Liang Peng、Xiaoguang Lu等作者完成，第一完成单位为广安门医院肾内科（中国中医科学院，北京），合作单位为中日友好医院临床医学研究所（北京）。该研究于2024年1月8日在线发表于Journal of Ethnopharmacology（《民族药理学杂志》）第324卷，论文编号117721。

该研究属于中药药理学与糖尿病肾病交叉领域，旨在探讨中药复方糖肾方保护糖尿病肾病足细胞凋亡的作用及其分子机制。糖尿病肾病是终末期肾病的主要原因，目前缺乏特效治疗药物。足细胞损伤是糖尿病肾病白蛋白尿的核心原因，而自噬-溶酶体系统的功能紊乱与足细胞稳态密切相关。作者在前期的临床与实验研究中已发现糖肾方对糖尿病肾病有治疗作用，但其潜在的分子机制尚不清楚。为此，本研究围绕转录因子EB介导的自噬-溶酶体通路展开，验证糖肾方是否通过激活该通路来降低足细胞凋亡。

本研究的实验流程分为体内与体外两部分。体内研究采用雄性KK/Ay糖尿病小鼠作为自发性2型糖尿病肾病模型，并以C57BL/6J小鼠作为正常对照。8周龄时根据体重及空腹血糖将KK/Ay小鼠随机分为四组：模型组、厄贝沙坦治疗组（每日22.5 mg/kg）、糖肾方提取两次组（每日3.57 g/kg）和糖肾方提取三次组（每日3.63 g/kg），每组6只；正常对照组6只。所有药物通过灌胃给药，每日一次，持续16周。期间每两周测量体重，每四周用竞争性ELISA法检测尿白蛋白与肌酐比值。24周龄时处死小鼠，收集血清和肾脏组织用于后续分析。肾脏组织分别进行H&E和PAS染色以评估肾小球系膜基质扩张，透射电子显微镜观察足细胞超微结构、足突宽度以及自噬泡数量，免疫组织化学染色检测肾小球LC3-II与p62，免疫荧光共染色检测WT1和TUNEL以判断足细胞凋亡，以及nephrin与LC3共定位以观察足细胞自噬。Western blot用于检测肾皮质中nephrin、WT1、cleaved caspase-3、LC3-II、p62、beclin1以及TFEB核转位相关蛋白。体外研究则从新生小鼠肾脏分离原代足细胞，通过WT1免疫荧光染色鉴定分化状态。足细胞分为BSA对照组、AGE-BSA刺激组以及AGE-BSA+TSF干预组；AGE-BSA浓度为100 μg/ml，TSF干预浓度为100 μg/ml。自噬流检测采用mRFP-GFP-LC3慢病毒转染方法：黄色斑点代表自噬体，红色斑点代表自溶酶体；此外还应用氯喹抑制自噬体与溶酶体的融合，并计算LC3-II净通量以反映自噬流。为研究TFEB在糖肾方抗凋亡作用中的必要性，采用siRNA沉默TFEB基因，再观察糖肾方对AGE刺激足细胞自噬和凋亡的影响。对实验数据的统计处理使用SPSS 20.0软件，多组间比较采用单因素方差分析及LSD检验，两组间比较采用Student’s t检验，P<0.05为具有统计学意义。

体内实验结果显示，与正常B6小鼠相比，KK/Ay小鼠体重和肾重/体重比明显增加，尿白蛋白肌酐比自12周龄起显著升高；糖肾方与厄贝沙坦治疗均可降低尿白蛋白排泄，且在24周龄时糖肾方提取两次组尿白蛋白肌酐比显著低于提取三次组。糖肾方治疗还可降低血浆肌酐和尿素水平，减轻肾脏肥大、肾小球增大、系膜扩张及糖原沉积。Western blot显示，KK/Ay小鼠肾皮质nephrin和WT1表达显著降低，cleaved caspase-3升高，而糖肾方治疗后这些变化被逆转。透射电镜显示模型小鼠肾小球基底膜增厚、足突增宽和融合，糖肾方明显改善这些超微结构异常。免疫荧光显示模型小鼠肾皮质WT1阳性细胞减少，TUNEL与WT1共染阳性细胞增多，提示足细胞凋亡增加，而糖肾方可减轻足细胞凋亡。自噬方面，KK/Ay小鼠肾小球中LC3-II和p62同时升高，说明自噬流受阻；糖肾方治疗降低了LC3-II和p62的累积，并增加beclin1水平。透射电镜观察到模型小鼠足细胞中自噬泡数量增多，而糖肾方治疗后自噬泡减少，提示糖肾方可能恢复了自噬流。体外实验中，AGE-BSA刺激原代足细胞后，LC3-II和p62呈剂量和时间依赖性累积，cleaved caspase-3和TUNEL阳性细胞增多；糖肾方干预可显著降低LC3-II、p62和cleaved caspase-3水平，并提高beclin1表达。使用氯喹阻断自噬流后，糖肾方的抗凋亡能力被部分抵消，说明其保护作用依赖于自噬。mRFP-GFP-LC3慢病毒转染结果显示，AGE刺激增加了黄色自噬体斑点数量并减少了红色自溶酶体斑点，而糖肾方逆转了这一变化，证明糖肾方可恢复自噬流。

机制研究发现，糖肾方可以促进TFEB的核转位。在KK/Ay小鼠肾组织中，核内TFEB水平显著降低，同时p-mTOR升高、PGC1α减少；糖肾方治疗提高了核TFEB及PGC1α水平，并抑制p-mTOR表达。体外实验中，AGES处理的足细胞经糖肾方干预后，核内TFEB显著升高，而胞质中TFEB无明显变化；免疫荧光也证实糖肾方促进TFEB进入细胞核。此外，糖肾方降低p-mTOR及p-p70S6K蛋白水平，提高TFEB靶基因PGC1α和ATP6V1D的表达。RT-PCR结果显示，糖肾方可显著增加TFEB、UVRAG、WIPI1、ATG9B、VPS11等自噬-溶酶体相关基因的mRNA表达。通过siRNA敲低TFEB后，糖肾方对LC3-II和p62降解的促进作用被消除，mRFP-GFP-LC3检测也显示糖肾方诱导自溶酶体形成和减少自噬体积聚的能力在TFEB缺失时受到抑制；同时，糖肾方抑制足细胞凋亡的作用也被明显削弱。这说明糖肾方发挥肾脏保护作用有赖于TFEB介导的自噬-溶酶体通路。

该研究的结论是：糖肾方可减轻糖尿病肾病足细胞凋亡并改善肾功能，其机制与激活TFEB介导的自噬-溶酶体通路、恢复自噬流有关。本研究的重要价值在于揭示了糖肾方治疗糖尿病肾病的分子靶点，为中药复方防治糖尿病肾病提供了新的实验依据；同时，该研究探讨了传统中药煎煮次数与疗效的关系，发现两次煎煮的糖肾方在降低蛋白尿方面优于三次煎煮，为优化中药制备工艺提供了参考。本研究的亮点包括：在体内与体外模型中系统评估了糖肾方对足细胞自噬流的影响，利用mRFP-GFP-LC3慢病毒转染和LC3净通量计算提供了自噬流动态变化的直接证据；通过TFEB基因敲低实验明确了TFEB在糖肾方保护足细胞中的必要性；并将传统中药制备与现代化药效评价结合，初步探索了不同提取次数对疗效的影响。该研究未来可能还需要进一步阐明糖肾方激活TFEB的上游分子机制，以及自噬功能障碍导致足细胞凋亡的具体信号通路。