本文属于类型a，即单一原创研究论文的学术报告。
该研究的主要作者为Cuong Quoc Nguyen、Thi Hong Minh Nguyen、Thi Thu Thuy Nguyen等，分别来自越南芹苴大学（Can Tho University）化学系、越南科学技术研究院（Vietnam Academy of Science and Technology）下属河内科技大学（University of Science and Technology of Ha Noi）生命科学系、维新大学（Duy Tan University）全球健康创新研究所、孙德胜大学（Ton Duc Thang University）计算化学研究组、越南科学技术研究院生物技术研究所与天然产物化学研究所，以及维新大学研究与发展研究所等机构。通讯作者为Minh Quan Pham、Quang De Tran和Hong Phuong Nguyen。论文发表于Hindawi旗下的Journal of Chemistry，卷号为2021，文章编号5567111，共10页，于2021年1月18日投稿，2021年3月13日修订，2021年4月1日接受，2021年4月19日正式在线发表。
该研究属于药物化学与抗病毒药物发现领域，针对寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）感染缺乏有效疫苗和特异性治疗药物的公共健康问题。寨卡病毒被世界卫生组织列为危险的蚊媒黄病毒病原体，与新生儿小头畸形及格林-巴利综合征等神经系统疾病密切相关。研究以小檗碱（berberine, BBR）为先导化合物。小檗碱是从中药黄连中提取的异喹啉生物碱，已被美国食品药品监督管理局批准为抗黄病毒登革病毒的有效药物，但存在生物利用度有限等不足。已有研究表明，对BBR进行结构修饰是获得更优药理活性衍生物的重要途径。本研究的目的是设计、合成一系列C-13位引入苄基的BBR衍生物及其相应的8-氧代小檗碱衍生物，通过分子对接模拟和基于细胞的表型实验评价其抗寨卡病毒活性，并解析其与寨卡病毒NS2B-NS3蛋白酶的结合模式、结合自由能及构效关系，寻找有潜力治疗寨卡感染的BBR衍生物。
该研究的完整工作流程可分为化学合成、分子对接研究和生物学评价三个主要阶段。第一阶段为化学合成。研究以市售的小檗碱氯化物（化合物1）为起始原料，先在0°C下与5.0 M NaOH溶液和丙酮反应，经搅拌、过滤、洗涤和减压干燥得到乙酰化中间体化合物2，产率为80%。随后将化合物2与不同的苄基卤代物或杂芳基苄基卤代物（化合物3a–d）在CH3CN溶剂中、NaI催化下于80°C反应4小时，反应混合物经过滤、二氯甲烷洗涤、萃取、硫酸钠干燥、浓缩和快速柱色谱纯化（二氯甲烷：甲醇，20:1至10:1）得到C-13位苄基取代的BBR衍生物4a–d。化合物5a–d则由相应的化合物4在20% KOH水溶液中于115°C回流24小时，经冷却、二氯甲烷萃取、干燥、蒸发和快速柱色谱纯化（乙酸乙酯：己烷，1:1至4:1）得到8-氧代小檗碱衍生物。所有合成化合物的结构通过¹H NMR确认，其化学位移、耦合常数和峰的裂分形式均在文中详细列出。第二阶段为分子对接研究。配体BBR及其8个衍生物的三维结构首先用ChemDraw 16.0构建，通过MM2力场进行能量最小化，并在Gaussian 09中用PM6半经验量子化学方法进行优化。以寨卡病毒NS2B-NS3蛋白酶为受体，其蛋白结构经过去除水分子、添加极性氢、赋予Kollman电荷和Gasteiger电荷，并用AutoDock Tools 1.5.6准备。对接采用AutoDock 4.2.6，网格盒子尺寸为80 × 80 × 80，格点间距为0.375 Å，网格位置覆盖His51、Asp75和Ser135等催化关键残基。拉马克遗传算法参数设置为：100次运行、精英数为1、突变率0.02、种群规模150、交叉率0.80、代数27000、能量评估25000000、RMS聚类容忍度2.0 Å。对接结果用PyMOL和Discovery Studio Visualizer分析。第三阶段为生物学评价。Vero细胞在含10%胎牛血清和双抗的DMEM培养基中培养。病毒采用非洲谱系寨卡病毒MR766株，以C6/36白纹伊蚊细胞扩增14天，分装后于-80°C保存备用。在抗病毒实验中，Vero细胞以2×10⁴细胞/孔接种于胶原预包被的96孔板中，实验前用化合物或阳性对照霉酚酸（mycophenolic acid, MA）按1:3倍比稀释的8个浓度预处理2小时，再加入MOI为1的寨卡病毒，感染24小时后用4%多聚甲醛固定并进行免疫荧光分析。一抗为泛黄病毒4G2抗包膜抗体，二抗为山羊抗小鼠Alexa647，并用Hoechst染核。每孔用10倍物镜获取三张图像，用ZEN Imaging和ImageJ软件分析。IC₅₀（半数有效抑制浓度）、CC₅₀（半数细胞毒性浓度）和选择性指数（selectivity index, SI）用Prism 7.0软件计算。数据处理采用8点剂量-反应曲线分析，每个实验重复至少两次独立进行。
在化学合成阶段，研究成功合成了8个BBR衍生物，包括4种13-苄基小檗碱衍生物（4a–d）和4种8-氧代小檗碱衍生物（5a–d），其结构通过¹H NMR谱图归属得到确认，且合成的关键中间体化合物2产率达80%，说明合成路线具有较高可行性。在分子对接阶段，所有配体的RMSD值均小于2.0 Å，说明对接结果可靠。对接得分以结合自由能越负表示亲和力越强，化合物5b得分最负为-7.65 kcal/mol，化合物4d次之，为-7.31 kcal/mol，4c为-7.29 kcal/mol，4a为-7.18 kcal/mol，BBR参比为-6.17 kcal/mol。但在结合模式分析中，化合物5b的相互作用残基Ala88、Ile123、Ala164、Ile165、Asp86和Thr166均不属于靶蛋白酶活性位点的关键组成残基，因此尽管其结合自由能最负，但不被视为进一步评价的“hit”。化合物4d的对接模式显示，His51、Ala132、Gly151、Gly153和Tyr161参与疏水相互作用，Phe84和Ser135与化合物形成氢键，尤其是4d的1,3-二氧戊环与Ser135羟基形成氢键，与参考抑制剂BBR相似，且多数相互作用残基为NS2B-NS3蛋白酶功能所必需。因此，结合对接得分和结合模式分析，化合物4d被假设为最具潜力的NS2B-NS3蛋白酶功能抑制剂。这一结论直接指导了后续生物学评价的解释。在生物学评价实验中，DMSO条件下感染细胞比例平均为60%，MA阳性对照可使感染细胞比例降至1%以下，证实实验体系有效。筛选结果显示，BBR、4a、4c和4d具有抑制寨卡病毒的活性，选择性指数均大于3。其中化合物4d表现出最强的抗病毒活性，IC₅₀为5.3 ± 1.9 μM，CC₅₀为80.9 ± 5.7 μM，SI达15.3，是BBR（SI为4.1）的3.7倍。化合物4c的IC₅₀为5.9 ± 2.2 μM，CC₅₀为44 ± 5.2 μM，SI为7.5，也优于BBR。化合物4a的IC₅₀为35.2 ± 7.1 μM，SI为3.2；化合物5b的IC₅₀为9.8 ± 1.4 μM，但CC₅₀仅为25.2 ± 7.5 μM，SI为2.6，其余化合物SI均低于3，抗病毒活性有限。上述结果表明，分子对接预测的化合物4d不仅在计算层面具有良好结合亲和力和关键残基相互作用，而且在细胞水平上确实表现出最强的抗寨卡活性，验证了计算与实验结果的相互支持。
该研究的结论是：小檗碱C-13位引入苄基的合成路线有效可行；在所有合成的13-取代BBR衍生物中，化合物4d的（2,6-二氟）苄基取代模式是实现成功非竞争性抑制的主要决定因素；化合物4d通过His51、Phe84、Ala132、Ser135、Gly151、Gly153及关键氨基酸Tyr161等残基与寨卡NS2B-NS3蛋白酶活性位点结合，并有与Ser135形成氢键的重要作用；其抗寨卡病毒IC₅₀为5.3 μM，SI为15.3，显著优于先导物BBR，是最有潜力的NS2B-NS3蛋白酶抑制剂候选物。该研究的价值在于为抗寨卡病毒感染提供了具有改善活性的小檗碱衍生物新骨架，同时通过分子对接和构效关系的结合，为开发针对寨卡NS2B-NS3蛋白酶的竞争性抑制剂提供了可靠平台。
研究的亮点包括：在BBR的C-13位引入杂芳族基团，通过连接臂和功能基团为额外的非共价芳族相互作用创造了有利的几何倾向；化合物4d不仅对接得分高（-7.31 kcal/mol），而且与酶活性位点关键残基形成结合，表现出优于BBR 3.7倍的选择性指数；研究将分子对接、结合模式分析和细胞表型实验有效结合，较完整地展示了从结构修饰到活性验证的链条。此外，研究还采用了PM6半经验方法对配体进行部分电荷计算，以提高AutoDock对接的准确性，BBR与Ser135的氢键作为活性关键相互作用的观点也为后续BBR衍生物的设计提供了结构依据。由于该研究仅在细胞模型中进行，尚需进一步开展体外和体内模型研究以确认其治疗应用。